一种用于提取、纯化线粒体的小分子探针及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种用于提取、纯化线粒体的小分子探针及其制备方法与应用，解决目前利用磁珠提取线粒体存在线粒体无法与磁珠有效分离且生物相容性低的问题，为线粒体植入以及未来工业化发展提供有效途径。本发明专利技术设计的小分子探针包括依次键合的线粒体靶向基团、聚乙二醇连接基团、光可控切断基团、以及叠氮基团；其通过非铜催化点击化学与DBCO

【技术实现步骤摘要】
一种用于提取、纯化线粒体的小分子探针及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物与新医药技术，具体涉及一种用于提取、纯化线粒体的小分子探针及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]衰老是多种慢性疾病的主要高危因，面对我国日益严峻的老龄化社会，各种慢性疾病将给家庭以及社会带来沉重的负担。仅神经退行性疾病一项，据统计65岁及以上老人中神经退行性疾病患病概率大约为10％，且其比例将随着年龄增长而逐渐增加。线粒体作为细胞内最重要细胞器之一，对细胞的基本功能及生存起决定性作用。一方面，作为细胞的“动力工厂”，线粒体主要通过氧化磷酸化产生维持细胞生存所需最为重要的储能分子三磷酸腺苷(ATP)。另一方面，线粒体在受到损伤时会释放活性氧(ROS)，细胞色素C等促进细胞凋亡的信号。因此一旦线粒体动态平衡受到破坏，会导致细胞ATP缺乏、线粒体损伤，可造成过量ROS或者细胞供能不足，并最终导致细胞死亡。许多研究表明，线粒体损伤在包括神经退行性疾病，癌症以及心血管疾病在内的许多慢性疾病的发生发展中起关键作用。然而目前针对线粒体损伤的治疗，标准方案主要为应对疾病症状，例如抗氧化药等，但是大部分的方案治标不治本，且缺乏明确的临床数据来支撑这些方案的有效性。
[0003]细胞治疗作为一个新兴的治疗技术，具有非常大的应用前景。细胞治疗对于线粒体损伤的方案是将健康的线粒体直接注入至线粒体损伤的组织中。动物实验已经证明，新鲜提取的线粒体在注入到小鼠心脏组织中之后，可以被心肌细胞获取，并且显著增强心脏活性。因此，基于线粒体的细胞治疗具有非常广阔的应用前景，而获得高活性以及高纯度的线粒体是线粒体细胞治疗至关重要的一环。
[0004]目前已有多种获得高纯度的线粒体方法被报道，最为广泛使用的方法是组分离心，其利用超高速离心机将细胞裂解液中的不同细胞器、组分进行分离与提纯。然而差速离心法(GC法)对仪器设备以及实验人员操作要求较高，并且提取的线粒体中一般同时含有溶酶体、内质网及过氧化物酶体等污染物。
[0005]近期多个课题组利用线粒体膜蛋白TOM22的抗体，特异性非共价连接细胞裂解液中的线粒体。这些方法极大的提高了线粒体提取的纯度，并且操作过程简单，避免了使用超高速离心机以及复杂且不稳定的实验操作过程，并利用磁珠和磁场力将抓取的线粒体进行有效的纯化；但是此方法也存在一定的缺点，限制了进一步在线粒体植入以及未来工业化的发展。首先，基于抗体和多肽的线粒体靶向基团制备和运输成本高昂；其次，在线粒体提纯之后，线粒体与磁珠之间将形成较为牢固的不可逆的连接；而作为非生物可降解的磁珠，线粒体
‑
抗体
‑
磁珠结合体对于获取线粒体的活性影响程度尚不可知。而之后的线粒体细胞植入，作为大粒径以及非生物降解的磁珠，对于植入之后的目标细胞及组织也存在安全隐患。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于解决目前利用磁珠提取线粒体存在线粒体无法与磁珠有效分离且生物相容性低的问题，限制了线粒体植入以及未来工业化发展，而提供一种用于提取、纯化线粒体的小分子探针及其制备方法与应用。
[0007]本专利技术的构思：
[0008]对于目前利用磁珠提取线粒体存在线粒体无法与磁珠有效分离，本专利技术研究团队考虑从改变磁珠与线粒体不可逆的连接着手，将磁珠与线粒体之间转变会可逆连接，通过将光可切断基团与线粒体靶向基团结合，设计一款多功能线粒体靶向小分子探针，从而解决目前线粒体磁珠提取方式中，磁珠无法与线粒体分离的问题。
[0009]为实现上述目的，本专利技术所提供的技术解决方案是：
[0010]一种多功能线粒体靶向小分子探针，其特殊之处在于：
[0011]包括依次键合的线粒体靶向基团、聚乙二醇连接基团、光可控切断基团、以及叠氮基团；
[0012]其中，所述线粒体靶向基团用于与线粒体外膜特异性结合；
[0013]所述聚乙二醇连接基团用于将线粒体靶向基团与光可控切断基团进行连接；
[0014]所述光可控切断基团在波长365
‑
400nm的光照射下，能够发生断裂；
[0015]所述叠氮基团用于非铜催化点击化学。
[0016]进一步地，所述探针为(1
‑
(4
‑
(2
‑
叠氮乙氧基)
‑5‑
甲氧基
‑2‑
硝基苯基)
‑
3，14
‑
二氧代
‑
2，7，10
‑
三噁
‑
4，13
‑
二氮杂环己烷
‑
16
‑
基)三苯基膦；其分子结构为：
[0017][0018]上述多功能线粒体靶向小分子探针的制备方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
[0019]1)分别合成(15，15
‑
二甲基
‑
3，14
‑
二氧代
‑
7，10
‑
二氧代
‑
4，13
‑
二氮杂癸基)三苯基膦及4
‑
(2
‑
叠氮乙氧基)
‑5‑
甲氧基
‑2‑
硝基苄基(2，5
‑
二氧吡咯烷
‑1‑
基)碳酸酯
[0020]其中，(15，15
‑
二甲基
‑
3，14
‑
二氧代
‑
7，10
‑
二氧代
‑
4，13
‑
二氮杂癸基)三苯基膦的合成步骤如下：
[0021]Ⅰ.(2
‑
羧乙基)三苯基膦的合成
[0022]将三苯基膦加入溶解有3
‑
溴丙酸的乙腈溶液中，在60
‑
80℃(优选80℃)下搅拌反应，薄层色谱检测至反应完成，对反应液真空浓缩并用有机溶剂(比如：氯仿、二氯甲烷或者乙酸乙酯，优选氯仿)提取残留物；
[0023]向有机相中加入乙醚沉淀出产物，收集产物并多次洗涤，旋干后得到(2
‑
羧乙基)三苯基膦；
[0024]Ⅱ.(15，15
‑
二甲基
‑
3，14
‑
二氧代
‑
7，10
‑
二氧代
‑
4，13
‑
二氮杂癸基)三苯基膦的合成
[0025]在惰性气氛(N2)下，将步骤Ⅰ得到的(2
‑
羧乙基)三苯基膦溶解在冰浴的无水二氯
甲烷中，再将1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与1
‑
羟基苯并三唑加入到上述体系中；15
‑
30min(优选15min)后加入N
‑
(2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多功能线粒体靶向小分子探针，其特征在于：包括依次键合的线粒体靶向基团、聚乙二醇连接基团、光可控切断基团、以及叠氮基团；其中，所述线粒体靶向基团用于与线粒体外膜特异性结合；所述聚乙二醇连接基团用于将线粒体靶向基团与光可控切断基团进行连接；所述光可控切断基团在波长365
‑
400nm的光照射下，能够发生断裂；所述叠氮基团用于非铜催化点击化学。2.根据权利要求1所述多功能线粒体靶向小分子探针，其特征在于：所述探针为(1
‑
(4
‑
(2
‑
叠氮乙氧基)
‑5‑
甲氧基
‑2‑
硝基苯基)
‑
3，14
‑
二氧代
‑
2，7，10
‑
三噁
‑
4，13
‑
二氮杂环己烷
‑
16
‑
基)三苯基膦；其分子结构为：3.权利要求1所述多功能线粒体靶向小分子探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)分别合成(15，15
‑
二甲基
‑
3，14
‑
二氧代
‑
7，10
‑
二氧代
‑
4，13
‑
二氮杂癸基)三苯基膦及4
‑
(2
‑
叠氮乙氧基)
‑5‑
甲氧基
‑2‑
硝基苄基(2，5
‑
二氧吡咯烷
‑1‑
基)碳酸酯其中，(15，15
‑
二甲基
‑
3，14
‑
二氧代
‑
7，10
‑
二氧代
‑
4，13
‑
二氮杂癸基)三苯基膦的合成步骤如下：Ⅰ.(2
‑
羧乙基)三苯基膦的合成将三苯基膦加入溶解有3
‑
溴丙酸的乙腈溶液中，在60
‑
80℃(优选80℃)下搅拌反应，薄层色谱检测至反应完成，对反应液真空浓缩并用有机溶剂提取残留物；向有机相中加入乙醚沉淀出产物，收集产物并多次洗涤，旋干后得到(2
‑
羧乙基)三苯基膦；Ⅱ.(15，15
‑
二甲基
‑
3，14
‑
二氧代
‑
7，10
‑
二氧代
‑
4，13
‑
二氮杂癸基)三苯基膦的合成在惰性气氛下，将步骤Ⅰ得到的(2
‑
羧乙基)三苯基膦溶解在冰浴的无水二氯甲烷中，再将1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与1
‑
羟基苯并三唑加入到上述体系中；15
‑
30min后加入N
‑
(2
‑
(2
‑
(2
‑
氨基乙氧基)乙氧基)乙基)新戊酰胺与N
‑
甲基吗啡啉，常温下进行反应，薄层色谱检测至反应完成，加入水淬灭反应，用二氯甲烷萃取，洗涤并干燥有机相、过滤、浓缩得到(15，15
‑
二甲基
‑
3，14
‑
二氧代
‑
7，10
‑
二氧代
‑
4，13
‑
二氮杂癸基)三苯基膦；4
‑
(2
‑
叠氮乙氧基)
‑5‑
甲氧基
‑2‑
硝基苄基(2，5
‑
二氧吡咯烷
‑1‑
基)碳酸酯的合成步骤如下：
①
.4
‑
(2
‑
溴乙氧基)
‑3‑
甲氧基苯甲醛的合成将香草醛溶解在乙腈中，再加入1,2
‑
二溴乙烷和碳酸钾，常温下进行反应，薄层色谱检测至反应完成；过滤反应体系形成的盐，浓缩滤液，得到黄色油状产物，静置转化为白色沉淀；在硅胶色谱柱上进一步纯化粗产物，洗脱得到4
‑
(2
‑
溴乙氧基)
‑3‑
甲氧基苯甲醛；
②
.4
‑
(2
‑
溴乙氧基)
‑5‑
甲氧基
‑2‑
硝基苯甲醛的合成在0
‑
4℃下，向步骤
①
得到的4
‑
(2
‑
溴乙氧基)
‑3‑
甲氧基苯甲醛中加入过量的冷却硝酸，搅拌15
‑
30min，然后升温至室温进行反应，薄层色谱检测至反应完成，加入水淬灭反应，过滤收集沉淀物，洗涤多次，得到4
‑
(2
‑
溴乙氧基)
‑5‑
甲氧基
‑2‑
硝基苯甲醛；
③
.(4
‑
(2
‑
溴乙氧基)
‑5‑
甲氧基
‑2‑
硝基苯基)甲醇的合成将步骤
②
得到的4
‑
(2
‑
溴乙氧基)
‑5‑
甲氧基
‑2‑
硝基苯甲醛溶解在乙酸乙酯中，全程保持避光，然后向其中加入溶解有硼氢化钠的氢氧化钠溶液，并在室温下搅拌反应，用盐酸中和反应液并用乙酸乙酯多次萃取，合并有机层，并进行干燥、过滤、减压浓缩得到淡黄色固体粗混合物；粗混合物通过快速柱色谱纯化，得到(4
‑
(2
‑
溴乙氧基)
‑5‑
甲氧基
‑2‑
硝基苯基)甲醇；
④
.(4
‑
(2
‑
叠氮乙氧基)
‑5‑
甲氧基
‑2‑
硝基苯基)甲醇的合成在惰性气体保护下，将步骤
③
得到的(4
‑
(2
‑
溴乙氧基)
‑5‑
甲氧基
‑2‑
硝基苯基)甲醇溶解在N,N
‑
二甲基甲酰胺中，加入叠氮化钠，避光60
‑
80℃搅拌进行反应，薄层色谱检测至反应完成，用乙酸乙酯稀释反应液，洗涤并干燥有机相、过滤、浓缩得到(4
‑
(2
‑
叠氮乙氧基)
‑5‑
甲氧基
‑2‑
硝基苯基)甲醇；
⑤
.4
‑
(2
‑
叠氮乙氧基)
‑5‑
甲氧基
‑2‑
硝基苄基(2，5
‑
二氧吡咯烷
‑1‑
基)碳酸酯的合成将步骤
④
得到的(4
‑
(2
‑
叠氮乙氧基)
‑5‑
甲氧基
‑2‑
硝基苯基)甲醇加入到溶解有三乙胺和N，N
‑
二琥珀酰亚胺基碳酸酯的乙腈中，在室温以及惰性气体保护的条件下搅拌进行反应，薄层色谱检测至反应完成；减压浓缩反应液，除去溶剂，残留物通过快速柱色谱纯化，得到4
‑
(2
‑
叠氮乙氧基)
‑5‑
甲氧基
‑2‑
硝基苄基(2，5
‑
二氧吡咯烷
‑1‑
基)碳酸酯；2)探针(1
‑
(4
‑
(2
‑
叠氮乙氧基)
‑5‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭勃，王海卫，李林，柏桦，鲁神赐，杨佳琦，薛宇飞，丁佳宇，
申请(专利权)人：西北工业大学，
类型：发明
国别省市：