一种含功能聚合物刷的磷酸化肽吸附剂及其制备与应用制造技术

本发明专利技术属于磷酸化肽富集材料技术领域，具体涉及一种含功能聚合物刷的磷酸化肽吸附剂及其制备与应用。其中磷酸化肽吸附剂具体以烯丙基缩水甘油醚和二甲基丙烯酸二乙二醇酯作为功能单体和交联剂制备得到一种大孔吸附树脂(MAR)微球，然后通过在大孔吸附树脂微球表面接枝一层带有环氧基团的聚合物刷形成聚合基质，最后依次磷酸化处理和钛(Ti4+)离子螯合修饰所述聚合基质，综上制备出可用于富集磷酸化肽的固定化金属离子亲和色谱吸附材料Ti4+

【技术实现步骤摘要】
一种含功能聚合物刷的磷酸化肽吸附剂及其制备与应用


[0001]本专利技术属于磷酸化肽富集材料
，具体涉及一种含功能聚合物刷的磷酸化肽吸附剂及其制备与应用。

技术介绍

[0002]蛋白质的翻译后修饰可以传递生物信号、运动刺激等信息，这些信息是蛋白质功能的重要调节因子。其中，可逆磷酸化是翻译后修饰中最重要的方法之一，它可以调节生命活动中的多种过程，从而控制各种细胞活动，包括细胞增殖、细胞分裂、细胞间信息传递和基因表达等。然而，在我们的日常生活中，蛋白质的异常磷酸化(如磷酸化途径的改变、过度翻译等)与多种疾病的形成有着密切的联系，如癌症和恶性肿瘤等(文献1，R.Gupta,et.al"Post
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translational modifications:regulators ofneurodegenerative proteinopathies"Ageing Res.Rev.2021,68,101336；文献2，X.Li,et.al"Recent advances in phosphopeptide enrichment:strategies and techniques"TRAC
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Trend.Anal.Chem.2016,78,70
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83)。因此，诊断和治疗磷酸化异常至关重要。
[0003]目前，由于真实生物样品的复杂性以及待测样品中磷酸化肽的低丰度和大量干扰肽的存在，使得对磷酸化肽进行直接质谱分析存在较大的困难(文献3,W.Qiu,et.al"Phosphopeptide enrichment for phosphoproteomic analysis
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atutorial and review ofnovel materials"Anal.Chim.Acta 2020,1129,158
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180)。因此，在质谱分析之前，对低丰度的磷酸化肽进行富集成为了必不可少的步骤。
[0004]固定化金属离子亲和色谱(IMAC)是一种常用的磷酸化肽富集方法，广泛应用于磷酸化蛋白质组学研究。该方法利用螯合在基质上的金属离子(如Fe(III)、Ti(IV)、Zr(IV)等)与磷酸肽之间发生的静电与螯合协同作用，可以从生物样品中特异性地吸附磷酸化肽段(文献4，韩彬等“固定化金属离子亲和色谱研究进展”科技导报,2017,35,92
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100)。但是，据报道，传统的IMAC材料更容易捕获整体磷酸化肽或单磷酸化肽，而对于多磷酸化肽的富集并不理想(文献5,R.Tang,et.al"Facile"one
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pot"preparation of phosphonate functional polythiophene based microsphere via friedel
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crafts reaction for selective enrichment ofphosphopeptides from milk"Anal.Chim.Acta 2022,1190,339268)。实际的，多磷酸肽在细胞行为的调控中承担着更多的功能，如细胞周期和蛋白质相互作用等(文献6，J.Li,et.al"Solvothermal synthesis ofnovel magnetic nickel based iron oxide nanocomposites for selective capture of global
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and mono
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phosphopeptides"Anal.Chem.2020,92,1058
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1067)。
[0005]综上，开发一种在生物或食品等复杂样品中更倾向于富集多磷酸化肽的材料具有重要的意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术涉及一种大孔吸附树脂(MAR)微球基质的磷酸化肽富集材料。具体分别以
烯丙基缩水甘油醚和二甲基丙烯酸二乙二醇酯作为功能单体和交联剂制备得到一种大孔吸附树脂微球，然后通过在大孔吸附树脂微球表面接枝一层带有环氧基团的聚合物刷形成聚合基质，最后依次用磷酸化处理和Ti4+离子螯合修饰所述聚合基质，制备出可用于富集磷酸化肽的吸附剂(Ti4+
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Brush@MAR)。
[0007]所述磷酸化肽吸附剂的结构式为：
[0008][0009]其中，左侧的圆球代表大孔吸附树脂微球。
[0010]具体制备过程包括如下步骤：
[0011]S1.制备单分散的大孔吸附树脂微球
[0012]以5～15mL/0.1～0.5g的比例将烯丙基缩水甘油醚与偶氮二异丁腈依次加入到浓度为2％～5％的聚乙烯吡咯烷酮溶液中，通氮除氧20～50min后在60～80℃的温度及70～100r/min的转速下旋蒸加热反应20～24h；离心洗涤反应后的产物，然后置于浓度为0.2％～0.5％的十二烷基硫酸钠溶液中，4℃环境下静置得到种子溶液；
[0013]以偶氮二异丁腈、烯丙基缩水甘油醚、二甲基丙烯酸二乙二醇酯、甲苯与环己醇的混合物为油相，以浓度为2％～5％的聚乙烯醇和0.2％～0.5％的十二烷基硫酸钠按照20～30mL/60～80mL的比例混合做为水相，将油相与水相以20～30mL/80～110mL的比例混合乳化，得到乳液；
[0014]室温条件下以150～250r/min的转速磁力搅拌种子溶液20～40min后加入乳液，种子量和乳液量的比例为8～12mL/100～140mL。接着通氮除氧20～50min并继续磁力搅拌20～40h，然后升温至60～80℃并保温反应20～24h，依次索提、洗涤、干燥反应后的产物，得到单分散的大孔吸附树脂微球；
[0015]S2.微球表面接枝聚合物刷形成聚合基质
[0016]以1～2g/20～40mL的比例将所述大孔吸附树脂微球分散于浓度为0.1～0.3mol/L硫酸溶液中，40～60℃条件下反应10～12h，然后将反应后的产物洗涤至中性并干燥得到酸化的大孔吸附树脂微球；
[0017]以1～2g/30～60mL的比例将酸化的大孔吸附树脂微球加入至二氯甲烷溶液中，150～300r/min的速度下冰浴搅拌10～40min，然后边搅拌边依次加入三乙胺、2
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溴异丁酰
溴和4
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二甲基氨基吡啶，维持冰浴反应2～3h后室温反应24h，洗涤并干燥反应后的产物得到大分子引发剂；
[0018]以0.5～2g/20～30mg/0.5～1mL/10mL的比例将大分子引发剂、2,2'
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联吡啶和甲基丙烯酸缩水甘油酯依次分散于乙醇
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水的混合溶剂中，其中乙醇
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水的混合溶剂中乙醇/水的体积比为4/1；
[0019]通过冷冻、抽真空和充氮的操作去除溶剂和反应体系中的氧气，以10mL/20～40mg的比例向溶剂中添加催化剂溴化亚铜，并且在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含功能聚合物刷的磷酸化肽吸附剂，其特征在于：以烯丙基缩水甘油醚和二甲基丙烯酸二乙二醇酯为原料制备单分散的大孔吸附树脂(MAR)微球；在所述大孔吸附树脂微球表面接枝一层带有环氧基团的聚合物刷，形成聚合基质；依次用磷酸化处理和Ti4+离子螯合修饰所述聚合基质，制备得到可用于富集磷酸化肽的固定化金属离子亲和色谱(IMAC)吸附材料。2.根据权利要求1所述的磷酸化肽吸附剂，其特征在于，所述的磷酸化肽吸附剂的结构式为：其中，左侧的圆球代表大孔吸附树脂微球。3.根据权利要求1所述的大孔吸附树脂微球，其特征在于：分别以烯丙基缩水甘油醚和二甲基丙烯酸二乙二醇酯作为功能单体和交联剂，采用种子溶胀法制备得到5～7μm单分散的大孔吸附树脂微球；将含有环氧基团的甲基丙烯酸缩水甘油酯功能单体利用原子转移自由基聚合(ATRP)技术接枝到所述大孔吸附树脂微球表面，得到材料表面形成一层致密聚合物刷的聚合基质Brush@MAR微球；通过环氧胺开环反应将O
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磷酸
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L
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丝氨酸修饰剂中的磷酸官能团引入所述聚合基质表面，得到改性的Brush@MAR微球；以硫酸钛为螯合剂，通过金属螯合作用将Ti4+离子固定到磷酸化改性的Brush@MAR微球表面，得到可以用于富集磷酸化肽的吸附剂Ti4+
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Brush@MAR。4.根据权利要求1或3所述的制备过程，其特征在于：S1.制备单分散的大孔吸附树脂微球以0.3～0.5g/6～8mL/6～8mL/6～8mL/6～8mL的偶氮二异丁腈、烯丙基缩水甘油醚、二甲基丙烯酸二乙二醇酯、甲苯与环己醇的混合物为油相，以浓度为2％～5％的聚乙烯醇和0.2％～0.5％的十二烷基硫酸钠按照20～30mL/60～80mL的比例混合作为水相。将油相，水相与种子量以20～30mL/80～110mL/8～12mL的比例混合，之后通氮除氧20～50min，并在常温下150～250r/min磁力搅拌20～40h，然后升温至60～80℃并保温反应20～24h，依次索
提、洗涤、干燥后，得到单分散的大孔吸附树脂微球；S2.微球表面接枝聚合物刷形成聚合基质将1～2g大孔吸附树脂酸化开环，之后以1～2g/30...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚波林，欧俊杰，韩速，王宏伟，
申请(专利权)人：宁夏伯特利活性炭有限公司，
类型：发明
国别省市：