本发明专利技术公开了一种生姜细胞外囊泡在制备用于促进毛囊干细胞增殖药物中的应用，包括生姜细胞外囊泡的快速分离方法，所述快速分离方法具体为，将生姜洗净，切块至于破壁机中匀浆过滤后，贯序离心过滤去除杂质，超速离心后，研磨震荡混匀，0.2μm滤器过滤浓缩后，至于4℃保存备用。本发明专利技术找到了分离生姜细胞外囊泡的快速分离方法，缩短了细胞外囊泡的分离时间，并验证了其在体内可促进毛囊干细胞增殖，这对利用生姜细胞外囊泡制备用于促进毛囊干细胞增殖的药物或者将其直接作为药物使用具有指导意义。意义。意义。
【技术实现步骤摘要】
生姜细胞外囊泡在制备用于促进毛囊干细胞增殖药物中的应用
[0001]本专利技术涉及毛囊干细胞增殖
，特别是涉及一种植物细胞外囊泡在制备用于促进毛囊干细胞增殖药物中的应用。
技术介绍
[0002]细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是一种由细胞分泌，直径在40～200nm左右的微小囊泡，其间包含了丰富的miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA以及蛋白质，能够参与细胞之间的物质转导和信号交流，并具有母源细胞的特异性，可以调控靶细胞的生理状态，包括促进细胞增殖、调控细胞周期等等。植物外泌体的生物学特性与哺乳动物相似，直径约40～200nm，形态结构也是具有磷脂双分子层结构，大多数植物细胞均可以分泌，在投射电镜下观察其形态同样呈茶托状或杯状，携带大量脂类、RNA和蛋白质。当前已有大量报道植物来源细胞外囊泡可以影响哺乳动物的细胞生理状态。
[0003]脱发是指头发脱落的现象。正常脱落的头发都是处于退行期及休止期的毛发，由于进入退行期与新进入生长期的毛发不断处于动态平衡，故能维持正常数量的头发。病理性脱发是指头发异常或过度的脱落，其原因很多，包括内分泌失调、精神创伤、血管机能紊乱及遗传等。现代人生活节奏快，工作生活压力大，长期熬夜、精神紧张等因素均可造成内分泌失调，影响头发的正常生理周期，出现脱发增加、发量变少等情况。
[0004]毛囊干细胞是存在于哺乳动物毛囊外根鞘隆突部中的一种特有干细胞，具有周期较长、分化能力强、自我更新及体外增殖能力强等特点，具有多种分子特异性标记物，如K15，K19，CD34，NANOG，NFATC1，α6
‑
Integrin，TCF3，TCF4，LHX2，SOX9和LGR5等标志物，其中NANOG和LGR 5被认为是干细胞的标志物。
[0005]毛囊干细胞具有多向分化潜能，它可以分化成表皮、毛囊、皮脂腺，参与皮肤创伤愈合的过程。毛囊再生是基于毛囊干细胞与毛乳头的复杂信号交互，其中外胚层组分的毛囊干细胞是再生毛囊的主要细胞来源，因此毛囊干细胞在毛发再生中有重要意义。
[0006]综上所述，本领域中亟需寻找一种可以有效解决脱发增加、发量变少等问题，促进毛发再生的药物或方法。
技术实现思路
[0007]本专利技术的目的是提供一种生姜细胞外囊泡在制备用于促进毛囊干细胞增殖药物中的应用。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案具体如下：
[0009]生姜细胞外囊泡在制备用于促进毛囊干细胞增殖药物中的应用，包括生姜细胞外囊泡的快速分离方法，具体为，使用贯序离心快速分离方法分离生姜细胞外囊泡。
[0010]所述贯序离心快速分离方法具体为，将生姜洗净，切块至于破壁机中匀浆过滤后，贯序离心过滤去除杂质，超速离心后，研磨震荡混匀，0.2μm滤器过滤浓缩后，至于4℃保存
备用。
[0011]所述生姜细胞外囊泡的分离方法具体为：
[0012]①
取500g生姜清洗去除表面泥垢，放入超声清洗仪中，超声震荡清洗30min后，超纯水浸泡5min清洗2次，清洗后沥干表面水渍，切块；
[0013]②
将生姜块放入植物破壁机中，加入500ml超纯水，低温破壁匀浆，匀浆后100目滤网过滤掉残渣，获得滤液，滤液再次使用200目细胞筛过滤；
[0014]③
滤液采用贯序离心法离心，依次为1000g 15min，2000g 20min，3000g 25min，5000g 30min，每次离心后取上清至一个新的离心管，开始下一次离心，最后获得的上清液使用0.2μm滤器过滤；
[0015]④
滤液加入快封超离管中，配平封口后，100000g,4℃，离心2.5h，离心结束后，生姜细胞外囊泡聚集在管底部，形成一个圆形沉淀物；
[0016]⑤
去除上清液，留底部圆形沉淀物，加入5ml PBS，用移液枪枪头将圆形沉淀物从底部剥离，并碾碎圆形沉淀物，吹打混匀形成沉淀物的浑浊液；
[0017]⑥
浑浊液加入剥离研钵管中研磨形成黄色液体，黄色液体移入15ml离心管，在涡旋振荡仪涡旋15min；
[0018]⑦
涡旋后5000g离心30min，取黄色上清液体，上清液使用0.2μm滤器过滤；
[0019]⑧
过滤后的滤液使用100KD超滤管3000g，4℃，离心15min后，取超滤管上部的生姜细胞外囊泡液体装入1.5ml EP管中备用。
[0020]通过上述方法分离获得的生姜细胞外囊泡可用于制备促进体内毛囊干细胞增殖相关的药物。
[0021]同现有技术相比，本专利技术的突出效果在于：
[0022]本专利技术找到了分离生姜细胞外囊泡的快速分离方法，缩短了细胞外囊泡的分离时间，并验证了其在体内可促进毛囊干细胞增殖，这对利用生姜细胞外囊泡制备用于促进毛囊干细胞增殖的药物或者将其直接作为药物使用具有指导意义，为毛发再生提供了新的方法。
[0023]下面结合附图说明和具体实施例对本专利技术所述的生姜细胞外囊泡在制备用于促进毛囊干细胞增殖药物中的应用作进一步说明。
附图说明
[0024]图1为生姜细胞外囊泡粒径分析。
[0025]图2为生姜细胞外囊泡透射电镜下形态图。
[0026]图3为生姜细胞外囊泡处理后毛囊内NANOG阳性细胞百分比。
[0027]图4为生姜细胞外囊泡处理后毛囊内LGR 5阳性细胞百分比。
具体实施方式
[0028](1)生姜细胞外囊泡分离
[0029]①
取500g生姜清洗去除表面泥垢，放入超声清洗仪中，超声震荡清洗30min后，超纯水浸泡5min清洗2次，清洗后沥干表面水渍，切块；
[0030]②
将生姜块放入植物破壁机中，加入500ml超纯水，低温破壁匀浆，匀浆后100目滤
网过滤掉残渣，获得滤液，滤液再次使用200目细胞筛过滤；
[0031]③
滤液采用贯序离心法离心，依次为1000g 15min，2000g 20min，3000g 25min，5000g 30min，每次离心后取上清至一个新的离心管，开始下一次离心，最后获得的上清液使用0.2μm滤器过滤；
[0032]④
滤液加入快封超离管中，配平封口后，100000g，4℃，离心2.5h，离心结束后，生姜细胞外囊泡聚集在管底部，形成一个圆形沉淀物；
[0033]⑤
去除上清液，留底部圆形沉淀物，加入5ml PBS，用移液枪枪头将圆形沉淀物从底部剥离，并碾碎圆形沉淀物，吹打混匀形成沉淀物的浑浊液；
[0034]⑥
浑浊液加入剥离研钵管中研磨形成黄色液体，黄色液体移入15ml离心管，在涡旋振荡仪涡旋15min；
[0035]⑦
涡旋后5000g离心30min，取黄色上清液体，上清液使用0.2μm滤器过滤；
[0036]⑧
过滤后的滤液使用100K本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.生姜细胞外囊泡在制备用于促进毛囊干细胞增殖药物中的应用。2.根据权利要求1所述的生姜细胞外囊泡在制备用于促进毛囊干细胞增殖药物中的应用，其特征在于：包括生姜细胞外囊泡的快速分离方法。3.根据权利要求2所述的生姜细胞外囊泡在制备用于促进毛囊干细胞增殖药物中的应用，其特征在于：使用贯序离心快速分离方法分离生姜细胞外囊泡。4.根据权利要求3所述的生姜细胞外囊泡在制备用于促进毛囊干细胞增殖药物中的应用，其特征在于：所述贯序离心快速分离方法具体为，将生姜洗净，切块至于破壁机中匀浆过滤后，贯序离心过滤去除杂质，超速离心后，研磨震荡混匀，0.2μm滤器过滤浓缩后，至于4℃保存备用。5.根据权利要求4所述的生姜细胞外囊泡在制备用于促进毛囊干细胞增殖药物中的应用，其特征在于：所述生姜细胞外囊泡的分离方法具体为：
①
取500g生姜清洗去除表面泥垢，放入超声清洗仪中，超声震荡清洗30min后，超纯水浸泡5min清洗2次，清洗后沥干表面水渍，切块；
②
将生姜块放入植物破壁机中，加入500ml超纯水，低温破壁匀浆，匀浆后100目滤网过滤掉残渣，获得滤液，滤液再次使用200目细胞筛过滤；
③
滤液采用贯序离心法离心，依次为1000...
【专利技术属性】
技术研发人员：白春雨，高玉花，
申请(专利权)人：济宁医学院，
类型：发明
国别省市：
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