一种新型酶法一锅合成β-烟酰胺单核苷酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种新型酶法一锅合成β

【技术实现步骤摘要】
一种新型酶法一锅合成
β
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烟酰胺单核苷酸的方法


[0001]本专利技术属于生物制药和生物化工
，尤其涉及一种新型酶法一锅合成β
‑
烟酰胺单核苷酸的方法。

技术介绍

[0002]β
‑
烟酰胺单核苷酸(β
‑
nicotinamide mononucleotide，NMN)是生物细胞内存在的一种活性核苷酸，是哺乳动物体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD
+
)补救合成途径的前体物质。NAD
+
广泛参与生物体内各种代谢反应，是生物体内必不可少的辅酶。在人体内，NMN通过转化为NAD
+
来发挥其生理功能，如激活NAD
+
底物依赖性酶sirt1调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。近年来有关NMN生物学功能的研究日益增加，如改善与年龄有关的病理生理和疾病状况、明显减轻与年龄有关的生理衰退、改善细胞能量状态、神经系统，并对心脏病、糖尿病、肥胖症、阿兹海默症等多种疾病显示出良好效果。因此，NMN在医药治疗以及功能性食品领域有着广泛的应用前景，也成为各大医药、功能性食品公司竞争的研究热点。β
‑
NMN的结构如下：
[0003][0004]现有NMN的合成方法主要分为化学法、酶法和发酵法。NMN化学法合成研究较早，主要以烟酰胺、三苯甲酰基
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β
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D
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核糖、四乙酰核糖等为原料，通过糖基化、磷酸化、氨解等步骤合成。2002年，Tanimori等用乙酰基保护的核糖与烟酰胺在三氟甲磺酸三甲基硅脂(TMSOTf)的催化下发生缩合反应，磷酸化后制得NMN；2004年，Palmarisa等改进了Tanimori的方法，对烟酰胺进行硅烷化保护后再与四乙酰核糖催化缩合，实现了NMN的立体选择性合成，其合成路线如下图：
[0005][0006]2018年，魏霞蔚等以烟酸乙酯与四乙酰核糖为起始原料，经TMSOTf缩合、脱乙酰基、三氯氧磷/磷酸三甲酯磷酸化、氨解后制备得到NMN。其合成路线如下图：
[0007][0008]2018年，索韦等将在氩气氛下，将烟酰胺核糖(NR)先与2，2
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二甲氧基丙烷反应，保护3、4位羟基，再与三氯氧磷/磷酸三乙酯磷酸化，最后用三氟乙酸或盐酸脱保护获得NMN。其工艺路线如下图：
[0009][0010]2019年，杜小兰等也改良了NMN合成过程中磷酸化的方法，以乙腈作为溶剂，吡啶作为缚酸剂使NR和率磷酸二苯酯发生酯化反应，然后通过金属催化加氢水解反应得到NMN。其工艺路线如下图：
[0011][0012]化学法合成NMN虽研究得较多，工艺改进、迭代也较快，但生产过程中所带来的环境污染仍较大，以及其合成步骤仍较长、收率仍不高使其合成成本仍然较高。
[0013]酶法合成NMN又分为半酶法和全酶法。半酶法是指先化学法合成烟酰胺核糖(NR)，NR在烟酰胺核糖激酶(NRK)催化作用下合成NMN。2016年，陶军华等以NR为底物，在磷酸基供体(ATP)存在下，在NRK或含有NRK的重组细胞下催化合成β
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NMN(WO2018120069)。其工艺路线如下图：
[0014][0015]由于此工艺的起始底物NR是化学法合成的，且成本较高，再加上磷酸基供体ATP的用量较大，生产成本较高，使得此工艺优势不明显。
[0016]全酶法工艺主要以烟酰胺(NAM)为底物，利用烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)将磷酸核糖焦磷酸(PRPP)供体中的磷酸核糖基转移至烟酰胺合成NMN。2018年，竺伟等以D
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磷酸核糖和烟酰胺为原料，在ATP存在下，用固定化含有磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRS)和NAMPT酶的重组细胞催化合成β
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NMN(CN201810940729.5A)。具体工艺路线如下图：
[0017][0018]此工艺的底物D
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磷酸核糖市场上基本没有，即使有价格也会较昂贵。因此，需要增加一步D
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磷酸核糖合成工艺。Marinescu等以D
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核糖为初始底物去合成PRPP，D
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核糖市场量较大且较便宜，使其合成的PRPP具有成本优势。其具体工艺路线如下：
[0019][0020]2018年，傅荣昭等通过定点突变的技术构建了一些NAMPT的突变体，以增强NAM和PRPP的催化能力，提升转化率。反应式如下：
[0021][0022]全酶法工艺是现在市场上主流的工艺，较化学法安全环保且成本更低。但其工艺路线有些长，各步骤中酶的催化活力不高，且有较强的产物抑制，致使产物β
‑
NMN的转化率和收率不高；加之过程中用到大量的ATP增加了生产成本。
[0023]最近也有一些研究者利用代谢工程手段对微生物合成NMN进行代谢路径改造，从而实现微生物发酵直接获得NMN。生物体内NMN的代谢途径如下图：
[0024][0025]胡志浩等以大肠杆菌(Escherichia coli)w3110为出发菌株利用基因敲除技术先后敲除了基因ushA、cdh、pncC、nadR、pncA、aphA、phoA、nadC、surE和nagD，且在细胞中重组外源基因nadV和nampt，构建了重组菌JN26K，发酵生产NMN达320mg/L(CN202010498755.4A)。此方法为NMN的合成提供了新的思路，但其NMN发酵产量太低，离工业化生产还有一定距离。
[0026]因此，需要开发一种替代化学合成、环保且安全且便于产业化生产，同时可大幅降低生产成本的β
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烟酰胺单核苷酸合成方法。

技术实现思路

[0027]本专利技术的目的在于提供一种新型酶法一锅合成β
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烟酰胺单核苷酸的方法，旨在解决化学法合成β
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烟酰胺单核苷酸工艺路线长、收率低、污染大且成本较高等问题，以及现有酶法工艺中存在的路线长、酶催化活性不高且ATP用量高造成生产成本较高等问题。为实现所述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种新型酶法一锅合成β
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烟酰胺单核苷酸的方法，包括以下步骤：
[0028]a、将烟酰胺、嘌呤核苷酸、焦磷酸钠加入水中搅拌分散均匀，加入HME005和HME006酶液得到溶液Ⅰ，将溶液Ⅰ于预定的温度、pH及常压下进行温和反应；
[0029]b、当溶液Ⅰ中的烟酰胺转化率达到预定数值时，对溶液Ⅰ降温、过滤分离得到滤液Ⅱ，将滤液Ⅱ调pH值除酶，再过滤分离，滤液纳滤浓缩得到纳滤浓液Ⅲ；
[0030]c、将纳滤浓液Ⅲ中加入95％浓度的乙醇使β
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烟酰胺单核苷酸结晶析出，过滤分离后的固体即为β
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烟酰胺单核苷酸粗品；
[0031]d、将β
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烟酰胺单核苷酸粗品进一步精制、真空干燥，即获本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型酶法一锅合成β
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烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：a、将烟酰胺、嘌呤核苷酸、焦磷酸钠加入水中搅拌分散均匀，加入HME005和HME006酶液得到溶液Ⅰ，将溶液Ⅰ于预定的温度、pH及常压下进行温和反应；b、当溶液Ⅰ中的烟酰胺转化率达到预定数值时，对溶液Ⅰ进行降温、过滤分离得到滤液Ⅱ，将滤液Ⅱ调pH值除酶，再过滤分离，滤液纳滤浓缩得到纳滤浓液Ⅲ；c、将所述纳滤浓液Ⅲ中加入95％浓度的乙醇使β
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烟酰胺单核苷酸结晶析出，过滤分离后的固体即为β
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烟酰胺单核苷酸粗品；d、将所述β
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烟酰胺单核苷酸粗品进一步精制、真空干燥，即获得β
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烟酰胺单核苷酸精品。2.根据权利要求1所述的一种新型酶法一锅合成β
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烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述a步骤中预定的温度为30～37℃，pH值为6.5～7.5。3.根据权利要求1所述的一种新型酶法一锅合成β
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烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述a步骤中...

【专利技术属性】
技术研发人员：李国庆，李思琦，
申请(专利权)人：深圳华酶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：