一种酶法合成胞苷的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶法合成胞苷的方法，属于生物制药和生物化工技术领域。本发明专利技术以胞嘧啶和嘌呤核苷为原料，在常温、常压、水相条件下，通过酶的特异性一锅法合成胞苷。反应液经过除酶、过滤、浓缩后加入乙醇结晶获得粗品，粗品进一步精制得到胞苷精品，精品HPLC纯度>99％，总收率>90％。本发明专利技术工艺为水相、常压、温和反应，环保且安全，比传统的化学合成法和微生物发酵法收率高、成本低，且更加环保安全。且更加环保安全。

【技术实现步骤摘要】
一种酶法合成胞苷的方法


[0001]本专利技术属于生物制药和生物化工
，尤其涉及一种酶法合成胞苷的方法。

技术介绍

[0002]胞苷(Cytidine)即胞嘧啶核苷，是由胞嘧啶的N
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1和D
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核糖的C
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1位置通过β糖苷键连接而成的化合物。是核糖核苷和脱氧核糖核苷合成的前体物质，在生物体内代谢调控中起到重要作用。胞苷作为重要的医药中间体，可用于抗病毒、抗肿瘤以及抗新冠药物的合成。例如扎西他滨(Zalcitabine)、卡培他滨(Capecitabine)、阿糖胞苷(Cytarabine)、环胞苷(Ancitabine)、胞磷胆碱钠(CDP
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Choline)、莫匹拉韦(Molnupiravir)等。胞苷的结构如下式：
[0003][0004]目前国内外胞苷的生产主要分为化学合成法和微生物发酵法。化学合成法主要是在苯甲酰氯保护下，在高压、超声波辐射条件下，以四乙酰核糖和胞嘧啶为底物，利用Lewis 酸催化剂，比如四氯化锡(SnCl4)、四氯化钛(TiCl4)等催化获得(姚其正，核苷化学合成，化学工业出版社，2005)。四氯化锡、四氯化钛不仅成本较高，且在生产过程中容易造成金属离子残留高、环境污染等问题。
[0005]也有研究者利用N4
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酰基胞嘧啶和四乙酰核糖在三甲基硅乙酸酯和B(C6F5)3催化下缩合得到酰基保护胞苷，再经酸性或碱性条件下脱保护得到胞苷，如中国专利技术专利 CN201810470464.7公开了一种合成胞嘧啶核苷的方法。其工艺方法如下式：
[0006][0007]此方法仍存在成本高、环保污染问题。
[0008]也有研究者采用酰基保护的糖类和酰基保护的胞嘧啶为底物，用酸性或偏酸性的离子液体作为催化剂，制备相应酰基保护的胞苷衍生物，然后皂化脱去保护基获得胞苷，如中国专利技术专利201210088690.1公开了一种制备胞苷的新方法。其工艺方法如下式：
[0009][0010]此工艺虽克服了vorbrueggen糖苷化法制备胞苷过程中N
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硅甲化后稳定性差、易脱保护进而影响后续反应的问题，但此方法仍存在成本高、环境污染问题。
[0011]胞苷发酵法生产在菌株的筛选、菌株的诱变、菌株的代谢工程改造研究以及发酵工艺的优化上经历几十年的不断探索研究。国外研究较早，以美国和日本的相关研究较为先进，特别是后者成功培育出具有胞苷脱氨酶缺失、3
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脱杂氮尿嘧啶抗性、5
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氟胞苷抗性、氨甲酰磷酸合成酶活力增强以及高丝氨酸脱氢酶活力缺失等特性的芽孢杆菌突变株，使其最大胞苷产率稳定在30g/L左右。枯草芽孢杆菌合成胞苷的代谢途径如下：
[0012][0013]国内相关研究起步较晚，以天津大学、天津科技大学、华东理工大学以及苏州华赛生物工程技术有限公司等科研院校或公司为代表，通过菌株的培育、诱变、基因敲除、遗传标记等技术手段获得一定的研究进展。Li等对枯草杆菌菌种进行了化学诱变和筛选，获得了突变菌株产胞苷为6.2g/L(Li，中国药科大学学报，2009)。Fang等在大肠杆菌K12 中对胞苷脱氨酶和高丝氨酸脱氢酶的编码基因进行敲除，同时过量表达来源于解淀粉芽孢杆菌的pyrB
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pyrA操纵子，胞苷产量达到0.72g/L(Fang，Biotechnol，2013)。也有研究者通过对大肠杆菌胞苷合成途径进行代谢工程改造，在5L罐中实现了20g/L的胞苷产量，如中国专利技术专利2017100038337公开了一种生产胞苷的重组微生物及生产胞苷的方法。其E.coli胞苷代谢途径如下：
[0014][0015]发酵法在成本和环保上比化学法优势巨大，但发酵需要的设备投资规模较大，且发酵过程中容易染杂菌甚至噬菌体，特别是大肠杆菌作为出发菌株进行发酵易染噬菌体溶罐，增加生产成本。
[0016]因此，需要开发一种替代化学合成、环保安全的胞苷合成方法，且对生产企业来说操作方便、投资少的胞苷合成工艺。

技术实现思路

[0017]本专利技术的目的在于提供一种酶法合成胞苷的方法，旨在解决所述
技术介绍
中化学法合成胞苷成本高、污染大等问题，以及发酵法合成胞苷需要投资大、生产过程中易染菌等问题。为实现所述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0018]一种酶法合成胞苷的方法，包括以下步骤：
[0019]a、将胞嘧啶、嘌呤核苷、磷酸盐加入水中搅拌分散均匀，调PH值后加入HME002酶液，于预定的温度、常压下进行温和反应；
[0020]b、当反应液中的胞嘧啶转化率达到预定数值时，加热终止反应，反应液降温冷却后过滤分离，滤液旋蒸浓缩得到浓缩液；
[0021]c、在上述浓缩液中加入95％浓度的乙醇使胞苷结晶析出，过滤分离后固体即为胞苷粗品；
[0022]d、将上述步骤得到的胞苷粗品进一步精制、干燥，即获得胞苷精品。
[0023]具体的，a步骤中预定的温度为35～40℃，pH值为7.0～8.0。
[0024]具体的，a步骤中嘌呤核苷包括肌苷(Inosine)、腺苷(Adenosine)、鸟苷(Guanosine)、黄嘌呤核苷(Xanthosine)。
[0025]具体的，a步骤中磷酸盐包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸三钠。
[0026]具体的，b步骤中胞嘧啶转化率的预定值为>99％，加热终止反应的温度为70～90℃，降温冷却温度为4～10℃。
[0027]具体的，c步骤中95％浓度的乙醇加入量为浓缩液体积的1.5～2倍。
[0028]具体的，d步骤中精制工序是，将胞苷粗品加入纯水中，溶解后加入活性炭脱色，过滤，向滤液中加入1.5～2倍体积的95％浓度的乙醇，在0～10℃下结晶，过滤分离，固体真空干燥后即得胞苷精品。
[0029]其中a步骤中发生的酶法合成胞苷反应式如下：
[0030][0031]与现有技术相比，本专利技术有以下有益效果：
[0032]1、本专利技术以胞嘧啶和嘌呤核苷为底物，利用酶的专一性一锅法合成胞苷，步骤简单、操作方便；
[0033]2、本专利技术工艺为水相、常压、温和反应，环保且安全；
[0034]3、本专利技术工艺转化率高，产物容易分离获得，收率高、成本低。
附图说明
[0035]图1为本专利技术实施例1提供的胞苷粗品HPLC图谱；
[0036]图2为本专利技术实施例2提供的胞苷成品HPLC图谱。
具体实施方式
[0037]为了便于理解本专利技术，下面将本专利技术进行更全面的描述。本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本专利技术的公开内容理解得更加透彻全面。下面结合具体实施方式对本专利的技术方案做进一步详细地说明。
[0038]实施例1
[0039]包括以下步骤：
[0040]a、胞苷的酶催化反应方法：
[0041本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶法合成胞苷的方法，其特征在于：包括以下步骤：a、将胞嘧啶、嘌呤核苷、磷酸盐加入水中搅拌分散均匀，调PH值后加入HME002酶液，于预定的温度、常压下进行温和反应；b、当反应液中的胞嘧啶转化率达到预定数值时，加热终止反应，反应液降温冷却后过滤分离，滤液旋蒸浓缩得到浓缩液；c、在上述浓缩液中加入95％浓度的乙醇使胞苷结晶析出，过滤分离后固体即为胞苷粗品；d、将上述步骤得到的胞苷粗品进一步精制、干燥，即获得胞苷精品。2.根据权利要求1所述的一种酶法合成胞苷的方法，其特征在于：所述a步骤中预定的温度为35～40℃，pH值为7.0～8.0。3.根据权利要求1所述的一种酶法合成胞苷的方法，其特征在于：所述a步骤中的嘌呤核苷包括肌苷(Inosine)、腺苷(Adenosine)、鸟苷(Guanosine)、...

【专利技术属性】
技术研发人员：李国庆，李思琦，
申请(专利权)人：深圳华酶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：