一种腐烂茎线虫的快速分离方法技术

本发明专利技术属于植物保护技术领域，具体涉及一种腐烂茎线虫的快速分离方法，包括以下步骤：将含有腐烂茎线虫的材料与质量分数30～40％蔗糖溶液混合，离心，所得上清液与沉淀分别过滤，收集滤液，滤液合并后离心，收集沉淀A；将沉淀A用质量分数70～80％蔗糖溶液分散均匀，缓慢加入水，离心，收集水与蔗糖溶液分界处的虫液，加水稀释后再离心，收集沉淀B，即得腐烂茎线虫虫体。本发明专利技术提供的快速分离方法，可以在短时间内快速富集腐烂茎线虫，并去除虫液中混杂的植物组织，同时可减少收集过程中的损耗、减少死亡，提高腐烂茎线虫的富集率。提高腐烂茎线虫的富集率。提高腐烂茎线虫的富集率。

【技术实现步骤摘要】
一种腐烂茎线虫的快速分离方法


[0001]本专利技术属于植物保护
，具体涉及一种腐烂茎线虫的快速分离方法。

技术介绍

[0002]腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)是一种国际检疫性线虫，严重危害马铃薯。该线虫在我国主要危害马铃薯与甘薯，一般引起田块减产30％～50％，严重时减产80％以上，甚至绝收。除了马铃薯与甘薯，腐烂茎线虫还可以危害番茄、辣椒、大豆、胡萝卜、黄瓜、花生、小麦、郁金香等多种植物，是重要的植物病原线虫。目前腐烂茎线虫已经在我国数个省份发生，生产中亟需开展相关研究，开发病害防控技术。
[0003]获取充足、纯净的腐烂茎线虫虫体是开展腐烂茎线虫相关研究的重要基础。目前，腐烂茎线虫收集方法主要为漏斗法和浅盘法或漏斗法与浅盘法的结合。其中漏斗法是在漏斗上放置单层滤纸或面巾纸，之后将发病薯块切成薄片置于滤纸或面巾纸上，加水至没过所有薯片，室温下静置24h。利用腐烂茎线虫亲水性与运动能力及其自身重力，最终可在漏斗底部收集得到腐烂茎线虫虫体。浅盘法操作及原理同漏斗法，区别在于将漏斗换为浅盘，并用筛子承载单层滤纸或面巾纸。但现有的线虫分离收集方法都需要腐烂茎线虫主动穿过滤纸或面巾纸，因此收集过程中难免会有损耗。而且现有的线虫分离方法通常需要较长时间的浸泡才能使得薯块中的虫体充分游离出组织，实现对薯块中腐烂茎线虫的大量收集，然而长时间的浸泡可能导致薯块长菌发霉，增加腐烂茎线虫死亡率。同时长时间的浸泡有可能导致滤纸或面巾纸破裂，造成收集到的虫液中有植物组织混杂，依赖现有技术无法有效去除虫液中的植物组织。
[0004]因此，提供一种可快速分离腐烂茎线虫的方法是十分有必要的。

技术实现思路

[0005]鉴于以上技术问题，本专利技术采用离心浮聚法可以在短时间内收集腐烂茎线虫，并通过密度梯度离心有效去除虫液中混杂的植物组织。
[0006]本专利技术提供一种腐烂茎线虫的快速分离方法，包括以下步骤：
[0007]将含有腐烂茎线虫的材料与质量分数30～40％蔗糖溶液混合，离心，所得上清液与沉淀分别过滤，收集滤液，滤液合并后离心，收集沉淀A；
[0008]将沉淀A用质量分数70～80％蔗糖溶液分散均匀，缓慢加入水，离心，收集水与蔗糖溶液分界处的虫液，加水稀释后再离心，收集沉淀B，即得所述腐烂茎线虫虫体。
[0009]优选地，所述含有腐烂茎线虫的材料与质量分数30～40％蔗糖溶液的体积比为1g∶2～10mL。
[0010]优选地，所述沉淀A与质量分数70～80％蔗糖溶液的体积比为1∶6～10。
[0011]优选地，所述离心是在2000～4000rpm离心5～10min。
[0012]优选地，所述过滤是过100目筛网，并用水多次冲洗筛网。
[0013]优选地，所述加水稀释是将虫液与水按体积比1∶5～10混合。
[0014]对比现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0015]1、本专利技术提供的腐烂茎线虫的快速分离方法，采用离心浮聚法收集腐烂茎线虫，可以在短时间内快速富集腐烂茎线虫，且通过密度梯度离心可有效去除虫液中混杂的植物组织。
[0016]2、本专利技术提供的快速分离方法，不需要借助腐烂茎线虫的自主运动即可快速分离，减少了收集过程中的损耗；同时，该方法也无需长时间浸泡处理，减少了腐烂茎线虫的死亡，提高了腐烂茎线虫的富集率。
附图说明
[0017]图1是实施例1中S3分离效果；
[0018]图2是实施例1最终得到的富集有腐烂茎线虫虫体的沉淀；
[0019]图3是对比例1分离虫体的显微观察；
[0020]图4是对比例2分离虫体的显微观察；
[0021]图5是实施例1分离虫体的显微观察。
具体实施方式
[0022]本专利技术结合实施例和相应附图做进一步阐释说明，以下实施例仅用于说明目的，不用于限制本专利技术范围。
[0023]本专利技术提供的快速分离方法，适用于腐烂茎线虫侵害的马铃薯、甘薯、番茄、辣椒、大豆、胡萝卜、黄瓜、花生、小麦、郁金香及当归、党参等多种植物组织或真菌菌体培养基中腐烂茎线虫的快速分离，由于所用材料的不同并不影响分离效果，故本专利技术实施例仅以腐烂茎线虫主要危害的马铃薯组织为例对其含有的腐烂茎线虫的分离效果进行说明，对其他含有腐烂茎线虫的材料中腐烂茎线虫的分离不再赘述。
[0024]实施例1
[0025]一种腐烂茎线虫的快速分离方法，包括以下步骤：
[0026]S1、用刀将含有腐烂茎线虫的病薯(取自发病马铃薯薯块)切成薯渣(类似于做馅)，将薯渣装入玻璃离心管中，向管内加入质量分数35％蔗糖溶液(35％蔗糖溶液与薯渣的用量比为2mL∶1g)，3000rpm离心5min，得到上清液及沉淀，薯块中的腐烂茎线虫即可从薯块中初步分离；
[0027]S2、将上清液与离心所得沉淀分别过100目筛网，并用10倍体积清水冲洗筛网上残留的薯渣，收集滤液，合并，这时上清液及薯渣中附着的腐烂茎线虫即可被全部分离至滤液中，同时薯块中的大块植物组织也被去除，有效避免其对线虫收集过程的干扰；
[0028]S3、将合并后的滤液装入玻璃离心管中，3000rpm离心5min，弃上清，收集沉淀；在该离心过程中，部分无法用筛网剔除的细小淀粉颗粒与线虫虫体一起分离，进而被沉淀富集；分离效果如图1所示；
[0029]S4、向收集有沉淀的玻璃离心管内加入相当于该沉淀6倍体积的质量分数80％蔗糖溶液，用胶头滴管反复吹打，使沉淀中的淀粉颗粒及虫体充分悬浮，形成溶液状态，避免大量沉淀聚集在底部而无法充分分散；
[0030]S5、用胶头滴管向玻璃离心管内缓慢贴壁加入2mL清水，确保新加入的清水与下层
质量分数80％蔗糖溶液形成分层而不混合，3000rpm离心5min，用胶头滴管收集清水与蔗糖溶液分界面上的虫液，转入新的玻璃离心管中，并立刻加入10倍体积清水并用胶头滴管反复吹打，充分稀释虫液；
[0031]室温下水的密度约为1.0g/mL，质量分数80％蔗糖溶液密度介于1.3～1.4g/mL，通过向蔗糖溶液中轻柔的加入清水以及离心，清水与蔗糖溶液可以分成明显的上下两层。这时淀粉颗粒由于密度较大，因此离心后会分布在蔗糖溶液中，形成大量沉淀聚集在离心管底部；而线虫虫体密度大于水而小于蔗糖溶液，因此离心后会分布在清水与蔗糖溶液的交界面处，从而有效地将虫体与细小淀粉颗粒分离；
[0032]将虫体用胶头吸管转出后快速且立刻加入大量清水能够对蔗糖溶液进行稀释，避免虫体在高浓度蔗糖溶液中长期浸泡；
[0033]S6、用玻璃离心管将稀释后的虫液在3000rpm离心5min，弃上清，收集沉淀，即得到腐烂茎线虫虫体，见图2方框标示处。此步骤可以重复2～3次，对收集到的虫体用清水反复洗涤，充分稀释蔗糖溶液，避免对虫体造成损伤。
[0034]实施例2
[0035]一种腐烂茎线虫的快速分离方法，与实施例1的不同仅在于：S1中所用蔗糖溶液的质量分数为30％，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种腐烂茎线虫的快速分离方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有腐烂茎线虫的材料与质量分数30～40％蔗糖溶液混合，离心，所得上清液与沉淀分别过滤，收集滤液，滤液合并后离心，收集沉淀A；将沉淀A用质量分数70～80％蔗糖溶液分散均匀，缓慢加入水，离心，收集水与蔗糖溶液分界处的虫液，加水稀释后再离心，收集沉淀B，即得腐烂茎线虫虫体。2.根据权利要求1所述的快速分离方法，其特征在于，所述含有腐烂茎线虫的材料与质量分数30～40％蔗糖溶液的用量比为...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨艺炜，常青，刘晨，彭德良，陈志杰，张锋，
申请(专利权)人：陕西省生物农业研究所，
类型：发明
国别省市：