【技术实现步骤摘要】
一种用于牛奶中大肠杆菌的比色检测方法
[0001]本专利技术属于食品安全检测
，具体涉及一种用于牛奶中大肠杆菌O157:H7的比色检测方法。
技术介绍
[0002]致病菌对食品的污染是全球健康的一个重大问题。大肠杆菌O157:H7属血清型大肠杆菌的一种，是导致食源性疾病产生的主要原因，能够引起出血性肠炎，发病率和死亡率较高。其中，乳制品是大肠杆菌O157:H7的重要污染途径，诸多研究表明，因摄入被O157:H7型大肠杆菌污染的乳制品而引起的人类消化道疾病时有发生。此外，大肠杆菌O157:H7的污染给人类生命健康带来严重伤害的同时，也给乳品行业带来巨大损失。因此，建立高特异性、高灵敏度的检测方法是有效防治大肠杆菌O157:H7的重要技术前提。
[0003]乳制品中大肠杆菌O157:H7的检测通常采用传统的微生物培养法，该方法灵敏度高且价格低廉，但劳动密集，需要高素质的人员，并且耗时3
‑
5天才能获得检测结果。其他检测方法还包括分子生物检测方法和免疫学方法，虽然这两种技术方法与传统的微生物培养法相...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于牛奶中大肠杆菌的比色检测方法，其特征在于，检测操作步骤如下：（1）制备待测液取1mL牛奶在5000
×
g条件下离心5min，弃去上清液，用1mL浓度0.1M、pH值7.4的无菌PBS缓冲液重悬沉淀，获得待测液；（2）扩增（2.1）在50μL双链探针溶液中加入200μL的待测液，在37℃条件下，孵育60min，在5000
×
g条件下离心5min，取上清液，即得复合溶液；所述双链探针是由适配体和目标DNA杂交制成；所述适配体的DNA序列为5
′‑
CCG GAC GCT TAT GCC TTG CCA TCT ACA GAG CAG GTG TGA CGG
‑3′
；所述目标DNA的DNA序列为5
′‑
GGC AAG GCA TAA GCG TCC GGA AAA AA
‑3′
；（2.2）在60μL复合溶液中加入50μL浓度200nM退火发夹探针溶液，再加入0.45μL浓度200U/μL的核酸外切酶III溶液和20μL的10
×
酶切缓冲液，加超纯水至终体积为200μL；在37℃条件下孵育75min，在70℃条件下加热20min，冷却至室温，获得扩增溶液；所述退火发夹探针为3
′
末端为单链游离端的茎环结构，所述退火发夹探针的DNA序列为5
′‑
GGC AAG GCA TAA GCG TCC GGA AAA AAC CGG ACG CTT ATG CCT TGC CAT GCC TTG CC
‑3′
；所述退火发夹探针中的茎环结构的DNA序列为5
′‑
GGC AAG GCA TAA GCG TCC GGA AAA AAC CGG ACG CTT ATG CCT TGC C
‑3′
；所述退火发夹探针中的3
′
末端单链游离的DNA序列为5
′‑
AT GCC TTG CC
‑3′
；（3）检测（3.1）在200μL扩增溶液中加入200μL多壁碳纳米管复合探针溶液，在37℃条件下，孵育50min，获得偶联物混合液；所述多壁碳纳米管复合探针由多壁碳纳米管化学偶联催化探针制成；所述催化探针由氨基化cDNA修饰的掺氯化钾的木质素碳点制成；所述cDNA的DNA序列为5
′‑
TTT TCC GGA CGC TTA TGC CTT
‑
(CH2)6‑
NH2‑3′
；（3.2）将400μL偶联物混合液置于磁力架上静置1min，取上清液作为催化复合溶液；（3.3）在催化复合溶液中加入50μL浓度100mM的过氧化氢（H2O2）溶液，再加入50μL浓度4.8g/L的3,3
′
,5,5
′‑
四甲基联苯胺（TMB）溶液，在25℃条件下避光反应15min，获得反应溶液；（4）检测结果的判定观察反应溶液的颜色变化，当反应溶液无色透明时，检测结果为阴性；当反应溶液为蓝色时，检测结果为阳性；取200μL阳性反应溶液放入到比色皿中，通过紫外分光光度计测定比色皿中反应溶液在654nm处呈现峰值的吸光强度；将654nm处的吸光强度值带入到检测方程中，计算得出待测液中的大肠杆菌O157:H7浓度，即完成检测。2.根据权利要求1所述的一种用于牛奶中大肠杆菌的比色检测方...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶应旺，任玉伟，凌娜，邹艳艳，姚悦，曹璐璐，张丹凤，沈益忠，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：
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