一种固载酶的富氮基金属有机骨架材料及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种固载酶的富氮基金属有机骨架材料及其制备方法，属于生物材料技术领域。本发明专利技术的目的是为了解决现有催化剂适用范围窄、酸性条件下不稳定的问题，通过“一锅”封装的原位生长法，进行富氮基金属有机骨架材料固载多酶的反应，构筑得到具有催化功能的复合材料；该骨架用于单酶、双酶及多酶的定位组装。该方法结合多酶位置分布，以实现在多级反应中，多酶间的高效协同，底物、中间产物的可控传递。递。递。

【技术实现步骤摘要】
一种固载酶的富氮基金属有机骨架材料及其制备方法


[0001]本专利技术涉及一种固载酶的富氮基金属有机骨架材料及其制备方法，特别涉及一种应用于级联反应的固载多酶的富氮基金属有机骨架材料和制备方法，属于生物材料


技术介绍

[0002]生物分子的封装或固定是指用固体材料将蛋白质、酶和核酸等生物分子限制或束缚于一定区域内，使其免于外界环境(如有机溶剂、温度、酸碱度等)的刺激而失活或变性。在过去的几十年里，二氧化硅、壳聚糖、寡肽、聚合物水凝胶、复合纳米材料等都显示出对生物分子的包覆保护能力。这种生物分子的无损封装固定，可有效地保持并提高生物分子的生物活性和稳定性，有助于模拟和控制生物催化反应的进程，并具有多次重复使用和操作连续可控等一系列优点。
[0003]金属有机骨架(Metal Organic Frameworks，MOFs)材料作为载体应用于功能性生物分子或生物体的固定或封装，是当下前沿的研究领域之一。在MOFs固载蛋白质所采用的多种构筑方法中，“一锅”封装的原位生长法具有快速固定蛋白质、反应条件温和、性能稳定等突出的优势。虽然MOFs材料在生物分子封装固定的应用方面展现了非常诱人的前景，但其桥连的金属配位键较弱，因而热稳定性或化学稳定性不足，制约了其实际的应用。例如，MOFs的化学稳定性较弱，外来的分子可以插入金属和配体形成的配位键中从而破坏框架结构，因此受有机溶剂、酸碱性溶液等苛刻外界环境的影响较大。
[0004]富氮MOFs是由氮杂环配体与金属离子自组装得到的，存在多种配位结构、氮环之间的π
‑
π堆积以及丰富的氢键，其结构复杂多变。从而该类MOFs有着独特的生物活性，并且具有毒性低、内吸性高等特点，常被用作医药和农药的结构组成单元，在抗细菌和病毒、抗真菌、抗肿瘤等方面起着重要的作用。但是富氮MOFs在固载生物分子尤其是生物酶方面多以甲基咪唑形成的ZIF材料为主，但其在酸性条件下易溶解使得所固定生物分子受到侵害失去活性，同时其他富氮分子及配合物用于固载生物分子的应用报道较少。因此，开发一种富氮MOFs，使其作为一种生物分子固载材料，在酸性条件下稳定、催化性能高效、固载量高、可重复使用且廉价易得具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了解决现有催化剂适用范围窄、酸性条件下不稳定的问题，提供一种固载酶的富氮基金属有机骨架材料及其制备方法；该骨架用于单酶、双酶及多酶的定位组装。该方法结合多酶位置分布，以实现在多级反应中，多酶间的高效协同，底物、中间产物的可控传递技术问题；
[0006]为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：
[0007]一种固载酶的富氮基金属有机骨架材料的制备方法：通过“一锅”封装的原位生长法，进行富氮基金属有机骨架材料固载多酶的反应，构筑得到具有催化功能的复合材料；
[0008]包括如下步骤：
[0009]步骤一、将A酶、偶氮三唑和Zn(NO3)2·
6H2O分散于水中，混合均匀，静置至有沉淀析出；通过离心分离得到沉淀，并将沉淀分散于十二烷基磺酸钠水溶液中继续搅拌，随后用蒸馏水将反应产物过滤洗涤，冷冻干燥；
[0010]步骤二、将步骤一中的产物分散于聚谷氨酸水溶液中；搅拌一定时间后，将产物通过Tris
‑
HCl缓冲液洗涤，再次分散于溶有B酶/聚谷氨酸、偶氮三唑、Zn(NO3)2·
6H2O的Tris
‑
HCl缓冲液中，搅拌反应，得到反应终产物；
[0011]步骤三、将反应终产物洗涤，冷冻干燥，得到颗粒内部与外表层同时分布有不同酶分子的多酶固定化材料。
[0012]优选的，所述的A酶和B酶包括水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂解酶、异构酶或连接酶。
[0013]优选的，所述A酶和B酶包括水解酶中的胰蛋白酶、脂肪酶、乙酰胆碱酯酶；氧化还原酶中的葡萄糖氧化酶、甲酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、过氧化氢酶、漆酶、辣根过氧化物酶、细胞色素C、乙酰胆碱酯酶；转移酶中的甲基转移酶、氨基转移酶；裂合酶中的碳酸酐酶；异构酶中的葡萄糖磷酸异构酶、磷酸丙糖异构酶；连接酶中的谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶。
[0014]优选的，步骤一所述A酶、偶氮三唑、Zn(NO3)2·
6H2O在水中的浓度比为(0.01
‑
5):(0.01
‑
10):(0.01
‑
10)，计量单位为g/L；沉淀产物与十二烷基磺酸钠的质量比为(1
‑
10):(50
‑
150)，计量单位为g。
[0015]优选的，步骤二所述B酶在Tris
‑
HCl缓冲液中的浓度为0.05
‑
0.5g/L，B酶与聚谷氨酸的质量比不超过100。B酶/聚谷氨酸、偶氮三唑、Zn(NO3)2·
6H2O在水中的浓度比为(0.01
‑
0.5):(0.01
‑
1):(0.01
‑
1)，计量单位为g/L。
[0016]优选地，步骤一、二所述混合搅拌反应的速度是400
‑
800rpm，反应时间为0.5
‑
2.5h，反应温度为30
‑
40℃；沉淀物与十二烷基磺酸钠的搅拌速度为400
‑
800rpm，搅拌时间为15
‑
30min，搅拌温度为25
‑
35℃。
[0017]优选地，所述步骤二第一次反应的搅拌速度为400
‑
800rpm，搅拌时间为1.5
‑
5h，搅拌温度为25
‑
35℃；第二次搅拌反应的时间为0.5
‑
2.5h，反应温度为30
‑
40℃，搅拌速度为200
‑
800rpm；所述Tris
‑
HCl缓冲液的浓度为0.02
‑
0.05mol/L，pH值为6.5
‑
7.5。
[0018]优选地，上述步骤中所述离心分离的转速为3000
‑
5000rpm，时间为10
‑
25min；过滤洗涤次数为3
‑
5次。
[0019]有益效果：
[0020](1)本专利技术的一种固载酶的富氮基金属有机骨架材料及其制备方法，无需复杂的工艺，条件温和，操作简便，极大地保留了酶的功能特性。
[0021](2)本专利技术的一种固载酶的富氮基金属有机骨架材料及其制备方法，利用富氮基金属有机骨架材料的生物矿化作用及聚合物与生物分子的静电吸引作用，实现对多种酶的组装，提升了联级反应的催化效率。
[0022](3)通过本专利技术方法制备的富氮基金属有机骨架固载酶复合材料表现出较高的耐酸性，循环使用多次仍然可保持较高的活性和选择性。
附图说明
[0023]图1为制得固定过氧化氢酶CAT的CAT@MOF...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种固载酶的富氮基金属有机骨架材料的制备方法，其特征在于：通过“一锅”封装的原位生长法，进行富氮基金属有机骨架材料固载单酶的反应，构筑得到具有催化功能的复合材料；将A酶、偶氮三唑和Zn(NO3)2·
6H2O分散于水中，混合均匀，静置至有沉淀析出；通过离心分离得到沉淀物，并将沉淀物分散于十二烷基磺酸钠水溶液中继续搅拌，再用水将反应产物过滤洗涤，冷冻干燥，得到单酶固定化材料，即A酶固定化材料；所述A酶包括：水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂合酶、异构酶或连接酶；所述A酶、偶氮三唑、Zn(NO3)2·
6H2O在水中的浓度比为(0.01
‑
5):(0.01
‑
10):(0.01
‑
10)，计量单位为g/L；沉淀物与十二烷基磺酸钠的质量比为(1
‑
10):(50
‑
150)，计量单位为g。2.如权利要求1所述一种固载酶的富氮基金属有机骨架材料的制备方法，其特征在于：通过“一锅”封装的原位生长法，进行富氮基金属有机骨架材料固载多酶的反应，构筑得到具有催化功能的复合材料；步骤一、将A酶、偶氮三唑和Zn(NO3)2·
6H2O分散于水中，混合均匀，静置至有沉淀析出；通过离心分离得到沉淀，并将沉淀分散于十二烷基磺酸钠水溶液中继续搅拌，随后用蒸馏水将反应产物过滤洗涤，冷冻干燥；步骤二、将步骤一得到的产物分散于聚谷氨酸水溶液中；搅拌一定时间后，将产物通过Tris
‑
HCl缓冲液洗涤，再次分散于溶有B酶/聚谷氨酸、偶氮三唑、Zn(NO3)2·
6H2O的Tris
‑
HCl缓冲液中，搅拌反应，得到反应终产物；B酶/聚谷氨酸、偶氮三唑、Zn(NO3)2·
6H2O在水中的浓度比为(0.01
‑
0.5):(0.01
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1):(0.01
‑
1)，计量单位为g/L；步骤三、将反应终产物洗涤，冷冻干燥，得到颗粒内部与外表层同时分布有不同酶分子的多酶固定化材料；所述A酶和B酶包括：水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂合酶、异构酶或连接酶。...

【专利技术属性】
技术研发人员：李冠男，李生华，庞思平，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：