一种利用UPLC-HRMS对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向分析方法技术

本发明专利技术涉及一种利用UPLC

【技术实现步骤摘要】
一种利用UPLC
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HRMS对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向分析方法


[0001]本专利技术涉及可疑的和未知的外源物质分析技术，尤其是一种利用UPLC
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HRMS对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向分析方法。

技术介绍

[0002]农兽药和合法批准的添加剂的使用受到世界各地相关法律法规的严格监管。对这些受管制化学品进行常规检测和定量分析，一般使用标准方法和有针对性的分析方法，如使用液相色谱
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三重四极杆质谱的多反应检测方法。然而，新的或改良的兽药、杀虫剂和其他未知的外源化学物质经常被有意地添加到食品中。此外，在生产、加工、运输和储存过程中也可能发生非故意的食品污染。这些未知的或不受控的外源物质很难用有针对性的分析方法进行检测。例如，三聚氰胺被添加到牛奶和婴儿配方奶粉中，常规的食品检测无法检测出来，直到大量儿童发病时才被发现。此外，在监管农药时，当需要检测的外源性化学品数量增加到数百种甚至超过1000种时，通过有针对性的分析方法对食品中的药物和其他外源性化学品进行监测就变得非常具有挑战性。
[0003]高效液相色谱
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高分辨率质谱联用(LC
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HRMS)正越来越多地应用于食品中兽药和农药的定量定性分析。LC
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HRMS应用可分为(1)使用标准方法对测试样品中大量已知分析物进行针对性分析；(2)可疑物筛查(在不使用标准方法的情况下搜索测试样品中“已知”或预测的兽药及其代谢产物)，(3)对检测样本中未知的外源物质进行非靶向分析。这三种方法也被应用于其他类型的外源性药物的分析，如毒理学检测和兴奋剂分析。
[0004]数据非依赖性采集定量技术(DIA)是使用LC
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HRMS对农药和兽药进行目标分析的一种成熟方法。DIA方法包括基于四极杆飞行时间(Q
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TOF)质谱联合SWATH质谱、基于轨道离子阱的可变DIA(vDIA)和多重DIA(mDIA)的序贯窗口采集。在LC
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HRMS的可疑物分子筛选中，离子列表相关的MS/MS获取(IL
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DDA)是一种选择方法。在分析过程中，将可疑外源性离子列入自动质谱/质谱采集列表中，将可疑外源性离子的质谱数据与检索结果进行匹配，完成对检测样品中可疑外源性离子的初步识别，从而获得了准确的测试样品的质谱和质谱/质谱数据。由于清单中所列离子的限制，这种方法可能无法成功筛选大量可疑的外来生物制剂。相比之下，DIA并不适合于可疑物筛选，因为由DIA产生的片段光谱通常含有来自洗脱内生组分的离子，这使得数据库搜索非常困难。
[0005]生物样品中未知外源性物质的鉴定是一个巨大的分析挑战，因为未知外源性物质的元素公式、分子离子和产物离子光谱是未知的，而且它在生物测试样品中的浓度可能相对较低。离子强度相关数据采集(II
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DDA)在全质谱扫描中根据未知离子强度触发质谱/质谱数据。该采集方法适用于分析高浓度未知外源生物，但不适用于复杂生物样品中低浓度未知外源生物的自动质谱/质谱采集。虽然DIA方法已被用于未知物的非靶向分析，但由DIA产生的片段光谱通常包含来自内生组分的离子，这使得他们的初步鉴定非常困难。此外，未知因素的非靶向分析需要非靶向数据处理方法，而为药物代谢物鉴定而开发的靶向数据处
理方法，如质量缺陷过滤法、萃取离子色谱法、产物离子过滤法等，在分析中是没有用的。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是为了克服现有的vDIA和II
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DDA方法在数据采集分析中存在的不足，提供一种利用UPLC
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HRMS对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向分析方法。
[0007]本专利技术的主要目标是开发一种新的基于高分辨率质谱(HRMS)的分析策略，用于回顾性分析可疑的和未知的外源物质，并评估其在猪肉样品中添加的48种“未知”兽药初步鉴定中的性能。在分析过程中，采用新开发的背景消除数据依赖采集(BE
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DDA)技术触发“未知”的产物离子(MS/MS)光谱采集，并采用内部精确彻底的背景消除法(PATBS)技术检测这些“未知物”。
[0008]本专利技术采用一个新的分析策略，用于生物样品中未知外源物质的回顾性可疑筛查和非靶向分析(如图1所示)。它依赖于新近引入的背景消除数据依赖采集(BE
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DDA)技术，用于检测样品中未知外源物质的非靶向MS/MS光谱采集。注意，这些外源性物质在对照样品中不存在。
[0009]进一步的，本专利技术采用内部精确彻底的背景消除法(PATBS)技术，对采集到的检测样品的全扫描LC
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MS数据集中的这些未知外源物质离子进行非针对性数据挖掘。该分析策略的有效性是通过检测和识别48种被认为未知的兽药，并将其添加到猪肉样本中来评估的。
[0010]本专利技术在自动MS/MS获取未知信息的成功率和获得的MS/MS光谱数据的质量方面，对比了BE
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DDA与vDIA和II
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DDA的性能。发现在猪肉兽药回顾性检测与鉴定中，基于BE
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DDA的工作流程与目前采用的DDA或DIA方法相比具有显著优势。
[0011]因此，通过BE
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DDA和PATBS技术不断改进，形成的分析策略有可能成为筛选大量或不定数量的可疑物质的实用工具，以及诸多未知的外源性物质在生物样品的分析，如分析食品中新的非法农药，人体血浆中草药的成分，以及运动员或赛马尿液中含有的提高成绩的药物等等。
[0012]具体方案如下：
[0013]一种利用UPLC
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HRMS对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向分析方法，包括以下步骤：
[0014](1)将兽药混合标准溶液加入新鲜猪肉匀浆，制备试验猪肉样品；另取新鲜猪肉作为对照猪肉样品，进行同样的匀浆，只是不添加兽药混合标准溶液；
[0015](2)分别称取所述试验猪肉样品和所述对照猪肉样品，进行预处理和纯化，分别得到检测样品和对照样品，具体包括：
[0016]2a预处理：将所述试验猪肉样品或所述对照猪肉样品放入离心管中，加入生理盐水和乙腈，得到的混合物进行兽药提取：用旋涡混合器将所述混合物充分混合，超声提取后进行离心，取上清液，即为A；吸取部分A转移至另一个离心管中，用同样的方法再次提取兽药残留，再取上清液，即为B；
[0017]2b纯化：将A与B两份上清液标本混合后使用HyperSep Retain
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PEP SPE柱进一步纯化，在相同的流速下进行样品富集，用乙腈洗脱完成富集过程后，将滤液收集起来，用氮气干燥，然后将干燥后的残渣重新溶解后进行离心，收集上清液用于UPLC
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HRMS分析；
[0018](3)进行UPLC
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HRMS分析
[0019]利用超高效液相色谱串联高分辨率质谱，分别对所述检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用UPLC
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HRMS对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向分析方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将兽药混合标准溶液加入新鲜猪肉匀浆，制备试验猪肉样品；另取新鲜猪肉作为对照猪肉样品，进行同样的匀浆，只是不添加兽药混合标准溶液；(2)分别称取所述试验猪肉样品和所述对照猪肉样品，进行预处理和纯化，分别得到检测样品和对照样品，具体包括：2a预处理：将所述试验猪肉样品或所述对照猪肉样品放入离心管中，加入生理盐水和乙腈，得到的混合物进行兽药提取：用旋涡混合器将所述混合物充分混合，超声提取后进行离心，取上清液，即为A；吸取部分A转移至另一个离心管中，用同样的方法再次提取兽药残留，再取上清液，即为B；2b纯化：将A与B两份上清液标本混合后使用HyperSep Retain
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PEP SPE柱进一步纯化，在相同的流速下进行样品富集，用乙腈洗脱完成富集过程后，将滤液收集起来，用氮气干燥，然后将干燥后的残渣重新溶解后进行离心，收集上清液用于UPLC
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HRMS分析；(3)进行UPLC
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HRMS分析利用超高效液相色谱串联高分辨率质谱，分别对所述检测样品和所述对照样品进行分析，分析过程中采用BE
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DDA智能数据采集方式获取高分辨率全扫描MS和MS/MS数据，包括：分析物的全扫描质谱数据集使用AcquireX获得，产品离子光谱数据集使用阶进更高能量碰撞诱导解离碰撞能量；采用背景消除数据依赖采集BE
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DDA方法获得检测猪肉样品的产品离子光谱和片段数据集，在BE
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DDA的数据采集中，连续N次UPLC
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HRMS注射，其中N为≥3的正整数，第一次和第二次注射作为准备步骤，在没有获取任何产品离子或片段光谱数据的情况下，记录控制和测试猪肉样品的全扫描质谱数据集，将这些数据集用来自动构建排除列表和包含列表；接下来的第三次注射进行MS/MS采集步骤，在每次注入后，包含和排除列表会自动更新；在MS/MS采集步骤过程中，根据纳入和排除名单中获得的信息，自动记录检测猪肉样品中感兴趣的分析物的产品离子光谱数据，并进行筛查和分析，以获得兽药可疑物信息。2.根据权利要求1所述利用UPLC
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HRMS对食品中兽药可疑物的筛查和非靶向分析方法，其特征在于：步骤(2)中分别准确称取1.0g的所述试验猪肉样品和所述对照猪肉样品，进行预处理和纯化，分别得到检测样品和对照样品，具体包括：2a预处理：将所述试验猪肉样品或所述对照猪肉样品放入10mL聚丙烯离心管中，加入2mL生理盐水和4ml乙腈，得到的混合物进行兽药提取：用旋涡混合器将所述混合物充分混合30s，超声提取15min，然后在室温下5000rpm离心10min，取上清液，即为A；吸取部分A转移至另一个10mL离心管中，用同样的方法再次提取兽药残留，再取上清液，即为B；2b纯化：将A与B两份上清液标本混合后使用HyperSep Retain
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PEP SPE柱进一步纯化，在开始纯化上清液之前，先通过3mL蒸馏水和1mL/min流速的甲醇活化SPE柱；然后，在相同的流速下进行样品富集，用3ml乙腈洗脱完成富集过程后，将滤液收集起来，用37℃的氮气干燥，然后将干燥后的残渣溶于100μL体积浓度为67％的甲醇的水溶液中，涡旋混合溶解后，12000rpm离心5min，收集上清液用于UPLC
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HRMS分析。3.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：王鹭骁，王东，陈富泓，方恩华，徐敦明，吴媛，
申请(专利权)人：厦门海关技术中心，
类型：发明
国别省市：