一种人脂肪组织冻存液及其应用制造技术

本发明专利技术涉及细胞技术领域，尤其涉及一种人脂肪组织的冻存液的应用。本发明专利技术提供的冻存液成分包括：MSC培养液、二甲基亚砜（DMSO）、右旋糖酐、FBS，该冻存液对脂肪组织具有良好的保护作用。本发明专利技术还提供了一种人脂肪冻存的方法，包括以下步骤：将预处理过的脂肪组织先用冻存液A液浸没组织并低温平衡，然后再使用冻存液B液进行冻存脂肪组织。以本发明专利技术提供的冻存液对脂肪组织进行冻存后，再经复融的脂肪组织中，细胞活性保持良好，且其阳性表面标志物的表达率＞95%，符合间充质干细胞的特性。符合间充质干细胞的特性。

【技术实现步骤摘要】
一种人脂肪组织冻存液及其应用


[0001]本专利技术涉及一种人脂肪组织冻存液及其应用。

技术介绍

[0002]近年来，随着医疗技术的不断更新以及人们对美的追求，使用自体软组织进行修复缺陷，为软组织填充提供了一个新方向。脂肪组织是由大量脂肪细胞聚集形成的一种软组织，自体脂肪因其容易获得，来源丰富，质地柔软，生物相容性好，移植后无免疫排斥现象，其含有大量的脂肪干细胞，具有很强的再生能力，且不会给患者增加额外的经济费用，目前在整形美容方面具有广泛的应用价值。但由于移植后的自体脂肪被部分吸收、存活率低等问题，需要通过多次手术反复注射来达到理想的效果。在进行脂肪移植前，需利用吸脂术来获得足够新鲜的脂肪组织，但是反复的抽吸脂肪，不仅给患者增加了痛苦，而且也会增加各种并发症发生的可能性。因此，为了达到“一次吸脂，多次使用”的目的，需一种脂肪组织冻存液以便长期安全有效的保存。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供一种用于保存人脂肪组织的冻存液，以克服脂肪组织长期保存的问题，解决“一次抽脂，多次使用”的问题。
[0004]本专利技术提供一种可长期冻存脂肪组织的冻存液及冻存方法，包括以下内容。
[0005]从专业的美容院在无菌条件下通过抽脂获得的脂肪组织放于无菌采集瓶中并低温保存。将采集瓶中的脂肪组织转移至离心管中，2000rpm离心5min，弃上层油脂和下层膨胀液，补加生理盐水，剧烈摇晃5
‑
6次，静置约30s后，弃下层清洗液，使用生理盐水清洗3
‑
5次，直到清洗液清澈为止，最后一次清洗时，2000rpm离心5min，弃下层清洗液和上层油脂。加冻存液混匀后，加至冻存管中并装入程序降温盒中，之后放
‑
80℃冰箱过夜降温。之后转入液氮罐中长期保存。
[0006]其中，所述的脂肪组织冻存液含A液和B液。A液含有培养液和DMSO；B液含有培养液、右旋糖酐、FBS和DMSO。
[0007]较好地，所述的脂肪组织冻存液A液含有体积分数为5%~15%的DMSO，体积分数为85%~95%的培养液。
[0008]较好地，所述的脂肪组织冻存液B含有体积分数为30~40%的培养液，体积分数为5~15%的DMSO，体积分数为20~30%的右旋糖酐和体积分数为15~45%的FBS。
[0009]所述的脂肪组织冻存液A液和B液中的培养液为MSC培养液。
[0010]本专利技术提供脂肪组织的冻存液使用方法为：先使用A液在4℃条件下对人脂肪组织进行平衡，然后利用B液对人脂肪组织进行冻存，以便在超低温条件下对人脂肪组织的长期保存，保护脂肪组织的生物活性不受影响。
[0011]本专利技术实施例中，先使用冻存液A液浸没脂肪组织低温平衡20min，然后以冻存液B液与脂肪组织的体积比为1：1进行冻存。
[0012]本专利技术实施例中，利用本专利技术提供的冻存液冻存脂肪组织，6个月复苏后进行原代分离培养，结果表明，复苏后的脂肪组织经消化分离获得脂肪干细胞的成功率为100％。培养至第三代后，流式检测脂肪干细胞表面标记物符合间充质干细胞的特性。
[0013]DMSO：二甲基亚砜，属于一种可渗透到细胞内的冷冻保护剂。在细胞悬液冷冻过程中，DMSO可渗透到细胞内部，可降低细胞内外未结冰溶液浓度差，保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免细胞过分脱水皱缩；DMSO与水分子结合，可使冰点下降，减少细胞内结晶的形成，从而减少由于冰晶的形成造成的细胞损伤。
[0014]右旋糖酐：属于非渗透性抗冻剂，能溶于水，但不能进入细胞，在特定温度下能有效降低溶液中低分子溶质浓度，提高细胞外的渗透压，减少细胞内的自由水，在冷冻过程中减少形成的冰晶对细胞的损伤，从而起到保护作用。
[0015]本专利技术中，添加FBS可提高脂肪组织复苏后细胞的存活率。
[0016]本专利技术中，培养液为MSC培养液，是一种间充质干细胞生长培养液。
[0017]本专利技术提供了一种脂肪组织长期保存的冻存液，右旋糖酐为非渗透性抗冻剂，可作为细胞外防护剂，DMSO具有高渗透性，为细胞内保护剂，两者结合使用，防止细胞在解冻的时候重新形成结晶，再结合FBS和一种间充质干细胞培养专用培养液，能够很好的保持脂肪组织的生物活性，以本专利技术提供的冻存液对脂肪组织进行冻存后，再经复融，分离培养后，细胞活性依旧保持良好的状态，且细胞表型也未发生变化。
具体实施方式
[0018]本专利技术公开一种人脂肪组织冻存液及其应用，该冻存液对脂肪组织具有良好冻存效果。本专利技术中所使用的试剂均可通过市售购买获得的常规试剂。
[0019]以下将结合实施例进行进一步阐述本专利技术。
[0020]1.脂肪组织前处理：脂肪组织从专业的美容院在无菌条件下通过抽脂获得的脂肪组织，抽取的脂肪组织装于无菌的采集瓶中，放2
‑
8℃保存。在0℃~25℃运送至实验室，在超净工作台中，将采集瓶中的脂肪组织分装于离心管中，2000rpm离心5min，弃上层油脂和下层膨胀液；加入足量的0.9%生理盐水，盖上离心管盖，用力晃动5
‑
6次，室温下静置30s，吸弃下层清洗液，重复清洗3
‑
5次，直至下层清洗液清澈为止，最后一次加生理盐水，2000rpm离心5min，弃上层油脂，并将脂肪组织转移至新的无菌离心管中。
[0021]2.脂肪组织的冻存：将提前配置好冷藏于4℃的脂肪组织冻存液A液加入上述收集的脂肪组织中，其中冻存液需浸没脂肪组织，混匀后放4℃冰箱平衡20min，之后2000rpm离心5min，收集脂肪组织，并以2mL每管分装于5mL冻存管中，再加等体积的脂肪组织冻存液B液，盖上冻存管管盖，上下颠倒混匀，装入程序降温盒中，放
‑
80℃冰箱过夜冻存，之后转入液氮管中保存6个月。
[0022]其中，所述的脂肪组织冻存液A液含有体积分数为10%的DMSO和体积分数为90%的培养液。
[0023]所述的脂肪组织冻存液B液含有体积分数为35%的培养液，体积分数为10%的DMSO，体积分数为25%的右旋糖酐和体积分数为30%的FBS。
[0024]所述的脂肪组织冻存液中的培养液为MSC培养液。
[0025]通过复苏消化脂肪组织分离培养脂肪干细胞验证冻存效果。
[0026]1.脂肪组织的复苏和脂肪干细胞的培养：取冻存了六个月脂肪组织，于37℃水浴锅中快速解冻，将解冻的脂肪组织转入离心管中，加入MSC基础培养液，2000rpm离心5min，弃上层油脂和下层液体，记录此时的脂肪组织体积，加入等体积的的0.1% I型胶原酶，混匀，放37℃摇床200rpm振荡消化45min，期间每隔15min用移液管吹打以加速消化，消化结束后1500rpm离心5min，弃上层液体，用MSC培养液重悬下层细胞沉淀，并用100μm的滤膜过滤，收集滤液，记录细胞数量及活率，1500rpm离心5min，弃上清，使用MSC完全培养液重悬细胞，并按照1*106/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人脂肪组织冻存液，其特征在于，冻存液包括：A液和B液。2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述的A液包括培养液和DMSO。3.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述的B液包括培养液、右旋糖酐、FBS和DMSO。4.根据权利要求2所述的冻存液，其特征在于，所述A液中的培养液为MSC培养基，其体积分数为90%；DMSO的体积分数为10%。5.根据权利要求3所述的冻存液，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘芝瑾，史淑红，杨江泽，
申请(专利权)人：山西遗传资源细胞库有限公司，
类型：发明
国别省市：