CCN3在调控血管平滑肌细胞钙化中的应用制造技术

本发明专利技术提供了CCN3在调控血管平滑肌细胞钙化中的应用。具体而言，本发明专利技术提供了CCN3作为靶点在筛选和/或制备调控平滑肌细胞钙化的试剂中的应用，本发明专利技术还提供了降低CCN3表达的试剂在制备抑制和/或缓解平滑肌细胞钙化的试剂中的应用。本发明专利技术证实了CCN3在Lp(a)介导的METTL14基因调控血管平滑肌细胞钙化发生发展中具有重要作用。中具有重要作用。

【技术实现步骤摘要】
CCN3在调控血管平滑肌细胞钙化中的应用


[0001]本专利技术是关于CCN3的新应用，具体而言，是关于CCN3基因和/或蛋白在调控血管平滑肌细胞钙化中的应用。

技术介绍

[0002]冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)全球疾病负担沉重。血管钙化是影响冠心病预后的重要危险因素，血管平滑肌细胞(Vascular smooth cell,VSMC)向成骨细胞的转化在血管钙化进展中起关键作用。
[0003]近年来有关脂蛋白a(Lp(a))与动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)相关性的研究越来越受到关注。临床研究证实Lp(a)水平与冠脉钙化存在相关性，早期实验研究也证实Lp(a)参与VSMCs钙化相关病理生理过程。
[0004]RNA的N6
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甲基腺苷(m6A)修饰是近年来心血管表观遗传领域新的研究热点。m6A修饰是真核生物信使RNA和长链非编码RNA中最普遍和最丰富的内部修饰，通过影响RNA的稳定性、降解和翻译从而在调节基因表达中发挥重要作用。全基因组关联研究(Genome
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wide association studies，GWAS)研究发现调控该过程的甲基转移酶METTL14基因定位于VSMC钙化易感区域。
[0005]既往研究报道，肾母细胞瘤过度表达蛋白(NOV/CCN3)基因在成骨反应中发挥重要作用，单细胞测序数据显示CCN3基因在SMC中富集表达。
[0006]VSMC钙化机制复杂，由多因素、多通路、多机制参与，如Runx2、Wnt/β
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catenin、NF
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kB、FGF23共同受体α
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Klotho等。然而，上述诸多靶点均尚未成功进行临床转化，导致目前尚无成熟的手段干预血管钙化。因此，亟需深入探究血管钙化新的分子机制，发现具备成功临床转化潜力的新的治疗靶点，对于从根本上减轻血管钙化相关疾病负担具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0007]本专利技术的一个目的在于研究血管钙化新的分子机制，提供关于血管钙化的新的治疗靶点。
[0008]本案专利技术人在研究中构建了Lp(a)蛋白在高磷酸盐溶液(高Pi)刺激中促进人主动脉平滑肌细胞(Human aortic smooth muscle cells,HASMCs)钙化表型，将Lp(a)诱导HASMCs钙化与METTL14诱导HASMCs钙化有机结合，并进一步筛选鉴定了METTL14下游靶基因CCN3，证明了CCN3基因介导METTL14基因调控HASMCs钙化，且证明了METTL14诱导的钙化表型能够被敲低CCN3逆转，进而提出了本专利技术。
[0009]具体而言，一方面，本专利技术提供了CCN3作为靶点在筛选和/或制备调控平滑肌细胞钙化的试剂中的应用。
[0010]另一方面，本专利技术提供了降低CCN3表达的试剂在制备抑制和/或缓解平滑肌细胞钙化的试剂中的应用。
[0011]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术中，所述CCN3为CCN3基因和/或蛋白。
[0012]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术中，所述平滑肌细胞为血管平滑肌细胞。
[0013]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术中，所述平滑肌细胞为动脉平滑肌细胞。
[0014]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术中，所述平滑肌细胞钙化包括由Lp(a)蛋白刺激促进的平滑肌细胞钙化。
[0015]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术中，所述平滑肌细胞钙化包括过表达METTL14基因引起的平滑肌细胞钙化。
[0016]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术中，所述降低CCN3表达的试剂包括敲低CCN3表达的试剂。
[0017]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术中，所述降低CCN3表达的试剂包括敲低METTL14基因的试剂。
[0018]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术中，CCN3可作为靶点用于筛选和/或制备减轻血管钙化相关疾病的药物。
[0019]在本专利技术的一些具体实施方案中，本专利技术利用Lp(a)处理人主动脉平滑肌细胞(Human aortic smooth muscle cells,HASMCs)，检测Lp(a)对HASMCs钙化的影响：培养HASMCs，分别用20μg/mL的Lp(a)蛋白和磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)处理，在含高Pi的成骨诱导培养基(Osteogenic medium,OSM)中培养14天后用茜素红染色检测钙化表型。在这些实施方案中，本专利技术构建了Lp(a)蛋白在高Pi刺激中促进HASMCs钙化表型，将Lp(a)诱导HASMCs钙化与METTL14诱导HASMCs钙化有机结合。
[0020]在本专利技术的一些具体实施方案中，本专利技术培养HASMCs，分别用20μg/mL的Lp(a)蛋白和PBS处理，培养48小时后分别提RNA和蛋白，检测METTL14基因的mRNA和蛋白表达水平；培养HASMCs，分别感染METTL14和GFP(对照)病毒，在含高Pi的OSM中培养14天后用茜素红染色检测钙化表型；培养HASMCs，分别用PBS+Si
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NC、Lp(a)+Si
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NC、Lp(a)+Si
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METTL14处理，在含高Pi的OSM中培养14天后用茜素红染色检测钙化表型。在这些实施方案中，本专利技术证明了Lp(a)通过调控METTL14的表达促进HASMCs钙化。
[0021]在本专利技术的一些具体实施方案中，本专利技术利用RNA
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seq技术对Ad
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METTL14处理的HASMCs进行测序，筛选出METTL14调控的下游靶基因；回复实验验证CCN3基因介导METTL14基因调控HASMCs钙化：培养HASMCs，分别感染METTL14和GFP(对照)病毒，然后在感染METTL14或GFP病毒的HASMCs中敲除CCN3基因，检测钙化表型。在这些实施方案中，本专利技术筛选鉴定了METTL14下游靶基因CCN3，证明CCN3基因介导METTL14基因调控HASMCs钙化。本专利技术还证明了Lp(a)通过调控METTL14表达水平，进而影响CCN3基因转录和翻译，从而在高Pi刺激中促进HASMCs钙化。
附图说明
[0022]图1A和图1B显示Lp(a)蛋白对HASMCs钙化表型的影响。其中，图1A显示镜下观：茜素红染色检测HASMCs中用20μg/mL Lp(a)蛋白诱导对细胞钙化表型的影响；图1B显示大体观：茜素红染色检测HASMCs中用20μg/mL Lp(a)蛋白诱导对细胞钙化表型的影响。
[0023]图2显示Lp(a)处理HASMCs上调METTL14蛋白表达。
[0024]图3A至图3C显示METTL14基因促进HASMCs钙化表型。其中，图3A显示镜下观：茜素
红染色检测HASMCs中过表达METTL14基因对细胞发生钙化表型的影响；图3B显示大体观：茜素红染色检测HASMCs本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.CCN3作为靶点在筛选和/或制备调控平滑肌细胞钙化的试剂中的应用。2.降低CCN3表达的试剂在制备抑制和/或缓解平滑肌细胞钙化的试剂中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述CCN3为CCN3基因和/或蛋白。4.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述平滑肌细胞为血管平滑肌细胞。5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述平滑肌细胞为动脉平滑肌细胞。6.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述平滑肌细胞钙化包括由Lp(a)...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴娜琼，王来元，李之凡，石惠薇，
申请(专利权)人：中国医学科学院阜外医院，
类型：发明
国别省市：