本发明专利技术公开了一种提高精液保存质量的常温保存稀释液及其制备和应用，所述稀释液包括基础稀释液以及添加在该基础稀释液中的阿魏酸，其中阿魏酸的浓度为25～100μmol/L，基础稀释液的组成为：以超纯水为溶剂，含有200～300mmol/L Tris、50～150mmol/L果糖、50～100mmol/L柠檬酸钠、5万IU/100mL青霉素和5万IU/100mL链霉素。本发明专利技术提供的稀释液可显著提高精液常温保存过程中精液质量，延长保存时间，有效解决了鲜精输精的时效性问题。有效解决了鲜精输精的时效性问题。
【技术实现步骤摘要】
一种提高精液保存质量的常温保存稀释液及其制备和应用
[0001]本专利技术属于动物繁殖
，具体涉及一种提高精液保存质量的常温保存稀释液及其制备和应用。
技术介绍
[0002]精液保存与人工授精技术相结合，在现代畜牧业生产中发挥着重要作用。精液保存分为常温、低温和冷冻保存三种方法，其中常温保存指在将精液稀释后保存在15～25℃条件下，常温保存具有操作简单、保存效果好、保存条件要求低和便于运输和人工授精效果好的优点。但是常温下保存，一方面微生物生长会迅速影响精液质量，另一方面精子活力下降较快，保存时间通常只有1～3天。
[0003]研究表明，在精液的常温保存过程中，由于精子质膜中存在大量的不饱和脂肪酸，容易受氧化应激影响而产生过量的ROS(Reactive Oxygen Species，活性氧)，导致精液中的氧化和抗氧化平衡体系遭到破坏。精子产生ROS是氧化代谢的正常结果，低浓度的ROS对于精子的功能具有重要作用，如精子的或能、顶体反应、精卵结合及相关信号通路等。高浓度的ROS通过脂质过氧化作用使精子活力和质膜完整性降低，DNA断裂增加，导致细胞凋亡，降低精液保存质量。
[0004]精液中存在的抗氧化防御平衡体系包括SOD、CAT、GPx、GR以及非酶抗氧化剂如蛋氨酸、抗坏血酸和α
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生育酚等。当精液进行体外保存时，由于产生ROS等原因，这种平衡很容易被打破，因此向精液中添加抗氧化剂或者其他物质充当保护剂很有必要。
技术实现思路
[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种常温保存稀释液，该稀释液能有效提高精液保存质量，延长常温下的保存时间。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]一种提高精液保存质量的常温保存稀释液，包括基础稀释液以及添加在该基础稀释液中的阿魏酸，其中阿魏酸的浓度为25～100μmol/L，基础稀释液的组成优选为：以超纯水为溶剂，含有200～300mmol/L Tris、50～150mmol/L果糖、50～100mmol/L柠檬酸钠、5万IU/100mL青霉素和5万IU/100mL链霉素。
[0008]在上述技术方案中，基础稀释液的最佳组成为：以超纯水为溶剂，含有Tris 250mmol/L、果糖100mmol/L、柠檬酸钠75mmol/L、青霉素5万IU/100mL、链霉素5万IU/100mL。
[0009]在上述技术方案中，阿魏酸的最佳浓度为50μmol/L。
[0010]上述常温保存稀释液的制备方法具体为：按配方称取含有Tris、果糖、柠檬酸钠、青霉素、链霉素和阿魏酸溶于超纯水中，混匀即得。
[0011]本专利技术还提供了上述常温保存稀释液在精液保存中的应用方法，具体为：将常温保存稀释液与新鲜精液分别预热后，用常温保存稀释液对精液进行稀释，将稀释之后的精液置于15～20℃下恒温保存。
[0012]进一步地，在上述技术方案中，稀释液和精液的预热温度均为33～38℃。
[0013]进一步地，在上述技术方案中，用常温保存稀释液稀释精液时，采用分布稀释的方法，稀释倍数可以为8～10倍。
[0014]进一步地，在上述技术方案中，精液来自于湖北黑头羊。
[0015]本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的常温保存稀释液可以有效提高精液常温保存活力，保存第5天活力仍然在80％以上，与未添加阿魏酸的基础稀释液相比，质膜完整性和顶体完整性也显著提高，ROS含量和MDA含量显著降低，总抗氧化能力也有一定的提高，而且操作简单有效，对于解决鲜精输精的时效性问题十分有效。
具体实施方式
[0016]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例及实验数据，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0017]下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0018]实施例1
[0019]本例提供的常温保存稀释液的组成为：基础稀释液和添加在该基础稀释液中的阿魏酸，其中阿魏酸的浓度为25μmol/L，基础稀释液的组成为：以超纯水为溶剂，含有Tris 250mmol/L、果糖100mmol/L、柠檬酸钠75mmol/L、青霉素5万IU/100mL、链霉素5万IU/100mL。
[0020]实施例2
[0021]与实施例1不同的是，阿魏酸的浓度为50μmol/L。
[0022]实施例3
[0023]与实施例1不同的是，阿魏酸的浓度为100μmol/L。
[0024]对比例1
[0025]与实施例1不同的是，本例中的常温保存稀释液不含有阿魏酸，仅有基础稀释液。
[0026]对比例2
[0027]与实施例1不同的是，本例中阿魏酸的浓度为200μmol/L。
[0028]使用各实施例和对比例制备的常温保存稀释液分别保存湖北黑山羊的精液，方法具体为：将采集的新鲜精液与稀释液分别置于37℃条件下预热，使用分步稀释法将精液与稀释液按照1:8稀释，将稀释后的精液用纱布包裹后放入17℃恒温冰箱，每隔12h摇晃一次。
[0029]对保存后的精液进行如下检测：
[0030](1)精子活力检测，采用HT CASA
ꢀⅡ
进行检测分析，具体步骤如下：
[0031]①
从各个处理组的样品管中随机取10μL精液，取之前缓慢摇匀，加入等温基础稀释液稀释至10倍，将其放置于37℃水浴锅孵育3min；
[0032]②
取孵育之后的精液5μL滴加在提前预热的载玻片上，盖上盖玻片后置于HT CASA
ꢀⅡ
恒温载物台，然后进行基础指标检测；
[0033]③
视野选取要求最少选择5个以上视野，观察精子总数不少于800个。
[0034]检测结果如表1所示：
[0035]表1不同浓度阿魏酸对黑头羊精子活力的影响(％)
[0036][0037]注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
[0038]从表1可知，在精液保存过程中，阿魏酸含量为25μmol/L、50μmol/L的稀释液，在精液保存过程中活力均显著高于不添加阿魏酸的对照组(P<0.05)。
[0039](2)精子质膜完整率检测，采用精子活体检测试剂盒进行，具体步骤如下：
[0040]①
将精子低渗膨胀液在水浴锅预热5min，取20μL精液加入200μL预热后的低渗液中，轻轻搅匀，37℃孵育30min；
[0041]②
孵育结束后取10μL均匀涂抹在载玻片上，光学显微镜观察，随机选取至少3个视野，精子总数不少于200个。
[0042]检测结果如表2所示：
[0043]表2不同浓度阿魏酸对黑本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种提高精液保存质量的常温保存稀释液，其特征在于，包括基础稀释液以及添加在该基础稀释液中的阿魏酸，所述阿魏酸的浓度为25～100μmol/L，所述基础稀释液的组成为：以超纯水为溶剂，含有200～300mmol/L Tris、50～150mmol/L果糖、50～100mmol/L柠檬酸钠、5万IU/100mL青霉素和5万IU/100mL链霉素。2.根据权利要求1所述的常温保存稀释液，其特征在于，所述基础稀释液的组成为：以超纯水为溶剂，含有Tris 250mmol/L、果糖100mmol/L、柠檬酸钠75mmol/L、青霉素5万IU/100mL、链霉素5万IU/100mL。3.根据权利要求1或2所述的常温保存稀释液，其特征在于，所述阿魏酸的浓度为50μmol/L。4.如权利要求1～...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊琪，韩世昌，张年，张凤，陶虎，杨娟，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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