一种免疫细胞冻存液及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种免疫细胞冻存液，包括培养基和添加在培养基中的以下成分：丝素蛋白、汉防己甲素、海藻糖、胰岛素、丙酮酸钠、L

【技术实现步骤摘要】
一种免疫细胞冻存液及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种冻存液，尤其涉及一种免疫细胞冻存液及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞。包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色。
[0003]近年来免疫细胞治疗被用在肿瘤、以及各种免疫系统缺陷引起的疾病中。免疫治疗的第一步要先采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力。体外培养的免疫细胞如暂时无需使用，可将培养得到的免疫细胞保存起来，待需要使用是再恢复细胞活性，常见的保存方法是将细胞在液氮中冻存。
[0004]细胞冻存是指将细胞放在低温环境(如液氮)，以达到减少细胞代谢的作用，从而达到对细胞进行长期储存进行保种的目的，以供后续实验或临床使用。常用的冻存液通常添加一定比例的二甲基亚砜(DMSO)。DMSO可以减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性，可以在细胞冻存过程中保护细胞。但是DMSO在常温条件下却对细胞有害，若DMSO未清洗干净，对复苏后细胞状态影响较大。使用普通含DMSO的冻存液冻存细胞，复苏后细胞活力显著下降，部分细胞表面抗原会随之丢失，细胞杀伤活性下降。采用液氮冻存多设备要求高，保存成本高，增加患者负担，因此有必要对免疫细胞的冻存液进行研究，进而实现在不添加DMSO，无需液氮保存的情况下使冻存后的免疫细胞保持较好的活性。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种免疫细胞冻存液，不添加DMSO，在
‑
80℃实现免疫细胞的长期保存。
[0006]本专利技术的目的之二在于提供一种免疫细胞冻存液的制备方法。
[0007]本专利技术的目的之三在于提供一种免疫细胞冻存液的应用。
[0008]本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：
[0009]一种免疫细胞冻存液，包括培养基和添加在培养基中的以下成分：丝素蛋白、汉防己甲素、海藻糖、胰岛素、丙酮酸钠、L
‑
谷氨酰胺。
[0010]进一步地，所述培养基为RPMI
‑
1640培养基，各成分在培养基中的用量为：丝素蛋白8.6
‑
12.5ng/mL、汉防己甲素5.3
‑
9.8ng/mL、海藻糖3.5
‑
7.2μg/mL、胰岛素1.5
‑
4.9μg/mL、丙酮酸钠2.8
‑
5.2ng/mL、L
‑
谷氨酰胺1
‑
5μg/mL。
[0011]进一步地，各成分在培养基中的用量为：丝素蛋白10.7ng/mL、汉防己甲素7.5ng/mL、海藻糖5.8μg/mL、胰岛素3μg/mL、丙酮酸钠4.1ng/mL、L
‑
谷氨酰胺2μg/mL。
[0012]进一步地，所述丝素蛋白的分子量小于3000Da。
[0013]本专利技术的目的之二采用如下技术方案实现：
[0014]上述免疫细胞冻存液的制备方法，包括以下过程：向培养基中加入丝素蛋白、汉防己甲素、海藻糖、胰岛素、丙酮酸钠、L
‑
谷氨酰胺混合均匀，在4℃保存备用。
[0015]本专利技术的目的之三采用如下技术方案实现：
[0016]上述免疫细胞冻存液的应用，包括以下步骤：将冻存液恢复至常温，然后加入至待保存的免疫细胞中，程序降温
‑
80℃保存。
[0017]进一步地，所述冻存液中免疫细胞的密度为1
‑6×
107cell/mL。
[0018]进一步地，所述免疫细胞为CIK细胞、NK细胞中的一种。
[0019]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供一种免疫细胞冻存液，在冻存液中添加丝素蛋白、汉防己甲素和海藻糖、胰岛素、丙酮酸钠等成分协同作用，实现了在
‑
80℃条件下长期保存免疫细胞，并且经保存的免疫细胞存活率高，杀伤活性不下降。该冻存液不添加DMSO，成分安全，有效降低免疫细胞的保存成本。
[0020]本专利技术还提供了一种免疫细胞冻存液的制备方法，过程简便易于操作，可将制备的冻存液保存于4℃，需要时恢复至室温即可。
[0021]本专利技术还提供了一种上述免疫细胞冻存液的应用，将待保存的免疫细胞用上述冻存液重悬后程序降温至
‑
80℃即可，无需液氮即能实现免疫细胞的长期保存，降低了免疫细胞的保存成本，减轻患者治疗负担。
附图说明
[0022]图1为本专利技术实施例1，实施例4，对比例1至8中免疫细胞的杀伤活性。
具体实施方式
[0023]下面，结合附图以及具体实施方式，对本专利技术做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
[0024]实施例1
[0025]一种免疫细胞冻存液，由RPMI
‑
1640培养基和添加在培养基中的以下成分组成：分子量小于3000Da的丝素蛋白、汉防己甲素、海藻糖、胰岛素、丙酮酸钠、L
‑
谷氨酰胺；各成分在培养基中的用量为：分子量小于3000Da的丝素蛋白10.7ng/mL、汉防己甲素7.5ng/mL、海藻糖5.8μg/mL、胰岛素3μg/mL、丙酮酸钠4.1ng/mL、L
‑
谷氨酰胺2μg/mL。
[0026]上述免疫细胞冻存液的制备方法，包括以下过程：向培养基中加入丝素蛋白、汉防己甲素、海藻糖、胰岛素、丙酮酸钠、L
‑
谷氨酰胺混合均匀，在4℃保存备用。
[0027]上述免疫细胞冻存液的应用，包括以下步骤：将冻存液恢复至常温，然后加入至待保存的CIK细胞中，冻存液中细胞的密度为3
×
107cell/mL，分装至2mL的冻存管中，放入程序降温仪降温
‑
80℃保存，程序降温过程为：首先以1℃/min降温至4℃，然后以5℃/min降温至
‑
20℃，最后以
‑
15℃/min降温至
‑
80℃。
[0028]实施例2
[0029]一种免疫细胞冻存液，由RPMI
‑
1640培养基和添加在培养基中的以下成分组成：分子量小于3000Da的丝素蛋白、汉防己甲素、海藻糖、胰岛素、丙酮酸钠、L
‑
谷氨酰胺；各成分
在培养基中的用量为：分子量小于3000Da的丝素蛋白8.6ng/mL、汉防己甲素5.3ng/mL、海藻糖3.5μg/mL、胰岛素1.5μg/mL、丙酮酸钠2.8ng/mL、L
‑
谷氨酰胺1μg/mL。
[0030本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种免疫细胞冻存液，其特征在于，包括培养基和添加在培养基中的以下成分：丝素蛋白、汉防己甲素、海藻糖、胰岛素、丙酮酸钠、L
‑
谷氨酰胺。2.根据权利1所述免疫细胞冻存液，其特征在于，所述培养基为RPMI
‑
1640培养基，各成分在培养基中的用量为：丝素蛋白8.6
‑
12.5ng/mL、汉防己甲素5.3
‑
9.8ng/mL、海藻糖3.5
‑
7.2μg/mL、胰岛素1.5
‑
4.9μg/mL、丙酮酸钠2.8
‑
5.2ng/mL、L
‑
谷氨酰胺1
‑
5μg/mL。3.根据权利2所述免疫细胞冻存液，其特征在于，各成分在培养基中的用量为：丝素蛋白10.7ng/mL、汉防己甲素7.5ng/mL、海藻糖5.8...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋紫辉，原征，
申请(专利权)人：南京紫风韵科技有限公司，
类型：发明
国别省市：