一种预处理间充质干细胞调理液的制备方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种预处理间充质干细胞调理液的制备方法，包括一个配制间充质干细胞完全培养液的步骤；配制IFN

【技术实现步骤摘要】
一种预处理间充质干细胞调理液的制备方法和用途


[0001]本专利技术属于生物化学领域，涉及一种细胞液，具体来说是一种预处理间充质干细胞调理液的制备方法和用途。

技术介绍

[0002]全身性系统炎症的基本病理变化是机体内促炎—抗炎自稳失衡所致的、伴有免疫防御功能下降的、持续不受控制的炎症反应。其中，神经系统炎症的影响尤为重要。炎症可通过不同途径激活炎症细胞，释放TNF
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α、IL
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1等促炎介质，参与机体防御反应。海马和大脑皮层区域的炎症因子基因表达升高，包括TNFα、IFNγ、IL6、IL10、CXCL12等。炎症作为机体免疫应答的重要机制之一，成为生命科学领域的研究热点之一。
[0003]MSCs因其低免疫原性、多向分化潜能和强大的免疫调节作用，成为再生医学临床治疗的潜在细胞来源。MSCs具有极强的迁移能力，能够靶向迁移到损伤组织，发挥抗炎和免疫调控的作用，通过旁分泌细胞因子促进损伤组织的修复。MSCs作为组织工程的种子细胞，用于修复多种组织和器官，如骨、软骨、韧带、肌腱、皮肤以及神经组织等，同时可以作为基因治疗的载体细胞，降低移植排斥反应，用于组织和器官移植。MSCs可以通过细胞间接触以及分泌可溶性免疫调节因子，参与机体的免疫调节。在MSCs培养过程中，其向培养液中分泌的生长因子及外泌体具有促进机体损伤修复的能力。
[0004]然而由于间充质干细胞不易通过血脑屏障，且容易堵塞血管，因此较难在中枢神经系统中发挥有效的作用。由于间充质干细胞具有旁分泌功能，通过旁分泌细胞因子促进损伤组织的修复，发挥抗炎和免疫调控的作用，因此现有手段多采用不含干细胞的上清液，由于上清液中含有生长因子、外泌体等成分，间充质干细胞上清液已经在多种动物疾病模型中被验证具有抗炎、调节体内免疫微环境的功效，因此展现出良好的应用前景。
[0005]目前，间充质干细胞上清液主要用于机体抗衰老、组织创伤修复、炎症修复等领域，然而由于间充质干细胞分离方法和培养环境的限制，导致间充质干细胞上清液中的有效成分不足，因此其上清液的治疗效果往往差强人意。基于此，本专利技术设计了一种预处理间充质干细胞调理液的制备方法和用途，以解决上述问题。

技术实现思路
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[0006]针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种预处理间充质干细胞调理液的制备方法和用途，所述的这种预处理间充质干细胞调理液制的制备方法和用途要解决现有技术中间充质干细胞上清液抗炎、免疫调控效果不佳的技术问题。
[0007]本专利技术提供了一种预处理间充质干细胞调理液的制备方法，包括如下步骤
[0008]1)一个配制间充质干细胞完全培养液的步骤，所述的间充质干细胞完全培养液由高糖DMEM培养基、血清替代物、肝素钠溶液组成；
[0009]2)配制IFN
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γ、TNF
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α小分子组合物储存液；
[0010]3)一个配制间充质干细胞预处理液的步骤，在步骤1)的间充质干细胞完全培养液
中加入步骤2)的小分子组合物储存液，使得IFN
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γ、TNF
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α的终浓度分别为8～12ng/ml。
[0011]4)一个培养步骤3)的间充质干细胞预处理液的步骤：当细胞长至汇合度为90
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100％时，胰酶消化细胞，计数，将1*10^5细胞接种于6孔板中或者1*10^6细胞接种于10cm细胞培养皿，培养18
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24小时；弃掉原有培养基，更换间充质干细胞预处理液，继续培养24小时；弃掉含有小分子组合物的培养基，PBS缓冲液洗涤至少两次，继续培养36小时以上；
[0012]5)一个浓缩收集间充质干细胞调理液的步骤：收集步骤4)的细胞上清，离心，去除死细胞和细胞碎片；
[0013]6)将步骤5)收集的细胞上清液转入超滤管中进行超滤，超滤管的型号为30KD，4000～4500rpm离心；冻存于
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80℃待用。
[0014]进一步的，所述的血清替代物占高糖DMEM培养基体积比例为5％，肝素钠溶液占高糖DMEM培养基+血清替代物总体积比例为0.032％。
[0015]进一步的，所述的高糖DMEM培养基、血清替代物、肝素钠的物料比为500ml:25ml:168ul。
[0016]进一步的，所述的高糖DMEM培养基是指葡萄糖的含量高于4500mg/L的DMEM培养基。
[0017]进一步的，所述间充质干细胞来源于人脂肪、骨髓、牙髓、脐带、胎盘或脐带血，选取的间充质干细胞为传代5次以内，且状态良好。
[0018]本专利技术还提供了上述的方法获得的一种预处理间充质干细胞调理液。
[0019]本专利技术还提供了上述的一种预处理间充质干细胞调理液在制备抗炎或者调节体内免疫的药物中的用途。
[0020]本专利技术采用IFN
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γ和TNF
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α两种小分子预处理间充质干细胞，能够激活NF
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κB信号通路和IFN
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γ信号通路，且IFN
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γ和NF
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κB信号通路与间充质干细胞的免疫调节能力呈现正相关。我们的研究表明，在体外细胞实验中，预处理能够增强间充质干细胞的免疫调控作用。同时，小分子组合物的预处理能够促进间充质干细胞分泌免疫相关的细胞生长因子及外泌体。综上，小分子组合物的预处理可有效提升细胞培养上清液在体内的免疫调节功能。
[0021]与现有手段多采用不含干细胞的上清液，用以体内抗炎、调节免疫功能相比，本专利技术制备的调理液在现有的间充质干细胞培养模式的基础上仅添加两种小分子，即可实现大幅度提高其抗炎和免疫调控的功效。
[0022]本专利技术创新性地提出一种预处理间充质干细胞调理液在治疗神经炎症小鼠中的用途，相比现有手段，本专利技术专利通过添加小分子组合物对间充质干细胞进行预处理的培养，所获得的细胞调理液能够极大地增强其在体内的抗炎和免疫调控功能，进而能够解决现有技术手段不足以高效起到抗炎效果的问题。
附图说明
[0023]图1：不同处理条件下小鼠评分的变化。
[0024]图2：不同处理条件下小鼠体重的变化。
[0025]图3：MSC1对照组和实验组小鼠大脑海马区域TNF
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α的mRNA表达水平。
[0026]图4：MSC1对照组和实验组小鼠大脑海马区域IL1β的mRNA表达水平。
[0027]图5：MSC2对照组和实验组小鼠大脑海马区域TNF
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α的mRNA表达水平。
[0028]图6：MSC2对照组和实验组小鼠大脑海马区域IL1β的mRNA表达水平。
具体实施方式
[0029]实施例1：脐带间充质干细胞的预处理
[0030](1)将两份脐带样本收集到装有含抗生素的缓冲液中，冰上运输至细胞间；
[0031](2)用含有抗生素的缓冲液洗涤脐带组织，转移至干净的培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种预处理间充质干细胞调理液的制备方法，其特征在于包括如下步骤1)一个配制间充质干细胞完全培养液的步骤，所述的间充质干细胞完全培养液由高糖DMEM培养基、血清替代物、肝素钠溶液组成；2)配制IFN
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γ、TNF
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α小分子组合物储存液；3)一个配制间充质干细胞预处理液的步骤，在步骤1)的间充质干细胞完全培养液中加入步骤2)的小分子组合物储存液，使得IFN
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γ、TNF
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α的终浓度分别为8～12ng/ml。4)一个培养步骤3)的间充质干细胞预处理液的步骤：当细胞长至汇合度为90
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100％时，胰酶消化细胞，计数，将1*10^5细胞接种于6孔板中或者1*10^6细胞接种于10cm细胞培养皿，培养18
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24小时；弃掉原有培养基，更换间充质干细胞预处理液，继续培养24小时；弃掉含有小分子组合物的培养基，PBS缓冲液洗涤至少两次，继续培养36小时以上；5)一个浓缩收集间充质干细胞调理液的步骤：收集步骤4)的细胞上清，离心，去除死细胞和细胞碎片；6)...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙毅，朱文敏，张春雪，
申请(专利权)人：朱文敏，
类型：发明
国别省市：