用于鉴定功能性疾病特异性调节性T细胞的方法技术

本发明专利技术涉及鉴定功能性疾病特异性，特别是肿瘤特异性调节性T细胞及其标志物的方法。本发明专利技术还涉及衍生的功能性肿瘤特异性调节性T细胞、标志物和工程化的调节性T细胞，以及它们用于诊断、预后、监测和治疗癌症的用途。监测和治疗癌症的用途。监测和治疗癌症的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于鉴定功能性疾病特异性调节性T细胞的方法


[0001]本专利技术涉及特别是癌症的免疫治疗领域。本专利技术涉及鉴定功能性疾病特异性，特别是肿瘤特异性调节性T细胞及其标志物的方法。本专利技术还涉及衍生的功能性肿瘤特异性调节性T细胞、标志物和工程化的调节性T细胞，以及它们用于诊断、预后、监测和治疗癌症的用途。

技术介绍

[0002]CD4+Foxp3+调节性T细胞(Treg)在维持免疫稳态和积极抑制对自身、肿瘤、微生物和移植物的免疫应答中起关键作用(Sakaguchi et al.,Int.Immunol.,2009,21,1105
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1111)。因此，理解Treg的生物学和功能是免疫学家的关键挑战，并且是改进用于疾病(特别是癌症)的诊断、预后、监测和治疗的当前方法的先决条件。
[0003]在许多人癌症中发现Treg的频率升高并且与不良的临床结果相关。在小鼠模型中，Treg的操作给出了令人印象深刻的结果。一方面，添加治疗性Treg或加强内源性Treg显示出抑制自身免疫(Churlaud et al.,Clin.Immunol.Orlando Fla,2014,151,114
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126；Gringer
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Bleyer et al.,J.Clin.Invest.,2010,120,4558
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4568)或炎症(Gaidot et al.,Blood,2011,117,2975
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2983；P
é
rol et al.,Immunol.Lett.,Dutch Society for Immunology,2014,162,173
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184)。另一方面，已经证明耗尽/失活Treg对于增加抗肿瘤(Alonso et al.,Nat.Commun.,2018,9,2113；Caudana et al.,Cancer Immunol.Res.,2019,7,443
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457；Fontenot et al.,Nat.Immunol.,2003,4,330
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336)或抗疫苗反应非常有价值。因此，已经提出将靶向Treg的治疗策略用于癌症治疗，包括但不限于：(i)基于Treg细胞的方法，包括在造血干细胞移植后注射耗尽Treg的供体淋巴细胞，用于治疗血液恶性肿瘤(Maury et al.,Sci.Transl.Med.,2010,2,41ra52
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41ra52)和(ii)诱导Treg细胞的选择性耗尽或功能改变的方法，包括；调节Treg相关途径的化学药品，如环磷酰胺(Lutsiak et al.,Blood,2005,105,2862
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2868)、氟达拉滨、吉西他滨和米托蒽醌(Dwarakanath et al.,Cancer Rep.,2018,1,e21105；Wang et al.,Cell Rep.,2018,23,3262
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3274)；耗尽Treg的抗体(如抗CTLA
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4、抗CD25、抗CCR5、抗CCR4；Dwarakanath et al.,Cancer Rep.,2018,1,e21105)；细胞因子和修饰的细胞因子，包括例如高剂量IL
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2(刺激癌症中的效应细胞)和对Treg或效应细胞具有特异性选择性的IL
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2衍生物(IL
‑
2/抗IL
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2复合物、聚乙二醇化IL
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2；表面重构的IL
‑
2变体(P
é
rol,L.,Piaggio,E.,2016.New Molecular and Cellular Mechanisms of Tolerance:Tolerogenic Actions of IL
‑
2,in:Cuturi,M.C.,Anegon,I.(Eds.),Suppression and Regulation of Immune Responses.Springer New York,New York,NY,pp.11
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28)。
[0004]然而，基于细胞的疗法非常昂贵和麻烦；并且尽管临床前数据已经给出了使用上述方法的坚实理由，并且一些正在进行临床评价，但是仍然存在发现用于治疗自身免疫/炎性疾病以及癌症的有效且选择性的靶向Treg的免疫疗法的医学需求。
[0005]阻碍翻译进入临床的主要障碍之一是难以鉴定独特的Treg标志物。实际上，Treg
表达高水平的CD25和Foxp3(Hori et al.,Science,2003,299,1057
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1061；Tran et al.,Blood,2007,110,2983
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2990)，但常规人CD4+T细胞(Tconvs)也可在活化后获得CD25和Foxp3，因此在Treg和活化的Tconvs的表型中存在大的重叠(Tran et al.,Blood,2007,110,2983
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2990)。
[0006]此外，Treg构成由微环境线索塑造的异质群体(Campbell and Koch,Nat.Rev.Immunol.,2011,11,119
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130；Feuerer et al.,Nat.Immunol.,2003,4,330
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336)。实际上，随着出现Treg转录组标签的研究，显然Treg不具有独特的分子标签。事实上，在稳态下，从不同组织(血液、淋巴组织、非淋巴组织)获得的Treg的独特分子模式表明Treg可以容易地响应周围的微环境，获得不同的迁移能力，激活不同的功能和代谢途径，并显示不同的功能；确定不同的Treg亚群。
[0007]此外，与不同病理相关的炎性环境可明显影响Treg分子特征和相关功能(Burzyn et al.,Nat.Immunol.,2013,14,1007
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1013；Chaudhry et al.,Science,2009,326,986
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991；Zhou et al.,Nat.Immunol.,2009,10,1000
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10074)。因此，为了有效地操纵Treg用于治疗目的，必须理解与每种病理学相关的独特Treg性状。
[0008]Treg和人癌症确实是要解决的一大难题。存在于肿瘤中的Treg可以具有不同的来源并通过多种机制抑制。文献中不断增长的数据表明肿瘤
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Treg可通过多种机制促进癌症进展，范围从效应T和NK细胞的直接抑制和骨髓细胞重编程为耐受性细胞，到不同基质细胞诱导产生抑制性分子(例如VEGF、IDO、前列腺素)，整体印记抑制性肿瘤
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微环境。此外，肿瘤特异性Treg可衍生自胸腺(tTreg)或它们可由天然T细胞转化成“外周诱导的”Tre本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种鉴定功能性疾病特异性调节性T细胞标志物的方法，其包括以下步骤：(a)从至少患者病变组织样品和患者外周血样品制备相似比例的分离的调节性T(Treg)细胞和常规T(Tconv)细胞的混合物；(b)对来自至少病变组织和外周血的分离的Treg和Tconv细胞的每种混合物进行单细胞基因表达谱分析与T细胞受体(TCR)谱分析的组合；(c)鉴定Treg细胞和Tconv细胞的簇，其中所述簇包含彼此差异表达的基因或基因特征；(d)在所鉴定的Treg细胞簇中确定至少一个功能性疾病特异性Treg细胞簇，其中所述至少一个簇包含：(i)相对于外周血，病变组织中具有较高比例的Treg细胞；(ii)病变组织中具有克隆扩增TCR特异性的较高比例的Treg细胞；以及(iii)病变组织中具有TCR触发、细胞活化和扩增的转录组特征的较高比例的Treg细胞；和(e)鉴定与所有其它鉴定的Treg和Tconv细胞簇相比在功能性疾病特异性Treg细胞簇中差异表达的基因。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者病变组织样品是患者肿瘤样品和/或步骤(a)中的患者样品包括患者病变组织样品、患者组织引流淋巴结样品和患者外周血样品，特别是患者肿瘤样品、患者肿瘤引流淋巴结样品和患者外周血样品。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述混合物由约50％的Tconv细胞和约50％的Treg细胞组成。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中步骤(b)中组合的单细胞基因表达谱分析和T细胞受体(TCR)谱分析通过单细胞RNA测序方法进行。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述至少一个功能性疾病特异性Treg细胞簇包含较高比例的过度表达以下一种或多种的Treg细胞：REL、NKKB2、NR4A1、OX
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40、4
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1BB、MHC II类分子，特别是HLA
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DR、CD39、CD137和GITR。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症；优选地，癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)；乳腺癌；皮肤癌；卵巢癌；肾癌和头颈癌；和横纹肌样瘤；更优选非小细胞肺癌。7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述疾病选自急性或慢性炎性疾病、变应性疾病、自身免疫性疾病或感染性疾病、移植物抗宿主病、移植排斥反应。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，还包括根据以下步骤对用于治疗目的的肿瘤特异性Treg标志物进行鉴定和排序：
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步骤1：鉴定和选择编码细胞膜蛋白，优选具有细胞外结构域的跨膜或GPI锚定蛋白的n个差异表达基因的部分；
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步骤2：测定n个所选基因在正常组织中的平均表达水平，并在正常组织中从具有最低表达水平的基因为
‑
1到具有最高表达水平的基因为
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n对每个基因分配至少一个得分A；
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步骤3：测定肿瘤组织中n个所选基因的平均表达水平，并在肿瘤组织中从具有最高表达水平的基因为+n到具有最低表达水平的基因为+1对每个基因分配至少一个得分B；
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步骤4：测定除Treg外的正常PBMC的n个所选基因的平均表达水平，并在除Treg外的正
常PBMC中从具有最低表达水平的基因为+n到具有最高表达水平的基因为+1对每个基因分配至少一个得分C；
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步骤5：测定除Treg外的肿瘤环境的n个所选基因的平均表达水平，并在除Treg外的肿瘤环境中从具有最低表达水平的基因为+n到具有最高表达水平的基因为+1对每个基因分配至少一个得分D；
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步骤6：测定i)肿瘤
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Treg与正常组织
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Treg相比，和ii)Treg与Tconvs相比n个所选基因的相对表达水平，并在i)(得分E)肿瘤Treg与正常相邻组织Treg相比，和ii)(得分F)Treg与Tconvs相比中从具有最高倍数变化表达水平的基因为+n到具有最低倍数变化的基因为+1对每个基因分配两个得分E和F；
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步骤7：对所分配的得分求和以获...

【专利技术属性】
技术研发人员：E，
申请(专利权)人：国家医疗保健研究所蒙苏里互助研究所，
类型：发明
国别省市：