抑制草果茎尖玻璃化的培养基及草果组织培养的方法技术

本发明专利技术涉及组织培养技术领域，尤其涉及抑制草果茎尖玻璃化的培养基及草果组织培养的方法。通过特定的消毒灭菌方法以及抑制茎尖玻璃化培养极大地提高了草果茎尖的存活率，通过特定的诱导培养基高效获得了胚性愈伤组织，为建立更高效的草果种苗离体再生体系和遗传转化体系奠定了坚实的基础。化体系奠定了坚实的基础。

【技术实现步骤摘要】
抑制草果茎尖玻璃化的培养基及草果组织培养的方法


[0001]本专利技术涉及组织培养
，具体涉及抑制草果茎尖玻璃化的培养基及草果组织培养的方法。

技术介绍

[0002]草果(Amomum tsao
‑
ko Crevost et Lemaire)为姜科豆蔻属多年生常绿丛生草本经济植物，又称草豆蔻、草果子、草果仁，适宜生长在海拔1200～2000米、年平均温度17～19℃、年平均降雨量1000～1600毫米、相对湿度80％～85％的阔叶林中，果实成熟呈红褐色。草果种植3～4年后即可开花结果，可连续结果20年以上，是传统的中药材和调味品，具有巨大的经济价值。
[0003]草果是怒江州重要的特色经济作物，全州草果种植面积和产量均占全省总量的一半以上，从海拔1500～3500米均有种植，种植面积达111万亩，主要分布在泸水县、福贡县及贡山县等地区，已成为“三区三州”山区民众的重要经济收入之一。2019年怒江州种植草果的产值达12.15亿元。
[0004]草果种苗繁育主要采用播种繁育与分株繁育2种方式，分株繁育是挑选长势优良健康母株的分生茎繁育种苗，用此法繁育的种苗遗传背景单一，能保持母株优良性状，且耗时短，但这种繁育方法经常会受到环境气候与母株状态的影响，无法大规模高通量繁育种苗。另外，草果母株由于种植年限长，存在种苗病毒积累现象，容易造成种苗产量下降，影响经济效益。而采用播种繁育方法，能够获得无病毒的脱毒种苗，但由于杂交使得性状分离，无法保留母株的优良性状。采取组织培养技术，能够保持母株的优良性状，并且避免遭受环境因素的干扰，短时间内能够获得大量优良种苗。此外，通过丛生芽诱导进行植株再生，能够摆脱对母株材料的限制，极大地提高草果种苗的繁育效率，达到高通量繁育种苗的目的，提高草果种苗产量与经济效益。因此组织培养技术对于草果种苗高通量繁育具有重要的实用价值。
[0005]目前已有相关研究开展了草果组培育苗，管朝旭等人通过诱导草果产生丛生芽建立了草果的快速繁殖体系，但未探究抑制草果茎尖玻璃化的方案。萧洪东等人利用草果茎尖进行组织培养快速繁育种苗研究，成功获得不定芽且移栽成活率高，但仍存在玻璃化和褐化等问题，导致茎尖的存活率和愈伤组织诱导率并不高。因此愈伤组织产生玻璃化现象是目前影响草果组织培养效果的主要问题，亟需解决。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供抑制草果茎尖玻璃化的培养基及草果组织培养的方法，本专利技术提供了草果幼嫩茎尖消毒灭菌方法、抑制草果茎尖玻璃化的培养基以及愈伤组织诱导的培养基和方法。
[0007]本专利技术提供了草果组织培养的培养基，包括抑制茎尖玻璃化培养基、初级愈伤诱导培养基、胚性增殖培养基；
[0008]本专利技术中，所述抑制茎尖玻璃化培养基为含有0.03～0.06mg/L TDZ、0.05～0.1mg/L NAA、0.1～0.5mg/L抗坏血酸、0.2～0.6mg/L PVP和2.5～3.5g/L活性炭的MS培养基；一些实施例中，所述抑制茎尖玻璃化培养基为含有0.03mg/L TDZ、0.05mg/L NAA、0.4mg/L抗坏血酸、0.4mg/L PVP和2.5g/L活性炭的MS培养基。
[0009]所述初级愈伤诱导培养基为含有1.5～2.5mg/L 6
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BA和0.1～0.5mg/L NAA的MS培养基；一些实施例中，所述初级愈伤诱导培养基为含有1.5mg/L 6
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BA和0.1mg/L NAA的MS培养基。
[0010]所述胚性增殖培养基为含有0.5～1.0mg/L 6
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BA和0.1～0.5mg/L 2,4
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D的MS培养基；一些实施例中，所述胚性增殖培养基为含有1.0mg/L 6
‑
BA和0.5mg/L 2,4
‑
D的MS培养基。
[0011]对于植物组织培养，培养基是其生长状况的关键因素之一，本专利技术提供的草果组织培养的三种培养基，通过对组分及配比进行筛选，最终获得配比合适的抑制茎尖玻璃化培养基、初级愈伤诱导培养基和胚性增值培养基。以所述抑制茎尖玻璃化培养基对草果脱毒茎尖进行培养，能够有效避免玻璃化的产生，抑制率可达100％，以所述初级愈伤诱导培养基和胚性增值培养基对草果健康茎尖进行愈伤组织的诱导，能够提高草果愈伤组织的诱导率。而采用其他植物激素或其他配比或浓度的组分，则无法获得类似的效果。
[0012]本专利技术提供的抑制茎尖玻璃化培养基、初级愈伤诱导培养基和胚性增殖培养基在草果组织培养中的应用。
[0013]本专利技术还提供了草果组织培养的方法，其包括：
[0014]将草果幼嫩茎尖作为外植体，消毒灭菌后依次用所述的抑制茎尖玻璃化培养基、初级愈伤诱导培养基、胚性增殖培养基进行培养，获得胚性愈伤组织。
[0015]在本专利技术中，所述草果组织培养的方法具体包括：
[0016]1：选取草果幼嫩茎尖作为外植体，去除多余叶鞘，消毒灭菌后获得脱毒的草果外植体；
[0017]2：将消毒后的茎尖接种到所述抑制茎尖玻璃化培养基中培养，获得无毒无玻璃化的健康茎尖；
[0018]3：将所述健康茎尖接种到所述初级愈伤诱导培养基中培养，获得愈伤组织；
[0019]4：将所述愈伤组织接种到所述胚性增殖培养基中培养，获得胚性愈伤组织。
[0020]步骤2中所述培养的条件为：温度20～25℃，黑暗培养30d～60d；
[0021]优选地，茎尖抑制玻璃化培养60d；
[0022]步骤3中所述培养的条件为：温度20～25℃，黑暗培养35d～45d；
[0023]优选地，愈伤组织诱导培养45d；
[0024]步骤4中所述培养的条件为：温度20～25℃，黑暗培养20d～35d；
[0025]优选地，胚性愈伤组织诱导培养35d。
[0026]采用本专利技术提供的所述培养基，抑制了草果茎尖玻璃化的发生，提高了茎尖存活率，诱导草果愈伤组织的成功率显著提高。
[0027]本专利技术中，所述消毒方法包括：
[0028]a：用百菌清溶液浸泡后，用流水洗净表面污垢；
[0029]b：用维生素C溶液浸泡后，用滤纸吸干水分；
[0030]c：转入超净工作台中，用75％酒精消毒后，无菌水冲洗1次；
[0031]d：用二氧化氯溶液浸泡后，无菌水冲洗3次；
[0032]e：用升汞灭菌后，无菌水冲洗4
‑
5次，沥干水分待用。
[0033]在一些实施例中，所述百菌清溶液的浓度为0.1wt％～0.2wt％，所述维生素C溶液的为5～8mg/L，所述二氧化氯溶液的浓度为100～150mg/L，所述升汞的浓度为0.05wt％～0.1wt％。
[0034]优选地，所述百菌清溶液的浓度为0.1wt％，所述维生素C溶液的浓度为5mg/L，所述二氧化氯溶液的浓度为150mg/L，所述升汞的浓度为0.1wt％。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.草果组织培养的培养基，其特征在于，包括抑制茎尖玻璃化培养基、初级愈伤诱导培养基、胚性增殖培养基；所述抑制茎尖玻璃化培养基为含有0.03～0.06mg/L TDZ、0.05～0.1mg/L NAA、0.1～0.5mg/L抗坏血酸、0.2～0.6mg/L PVP和2.5～3.5g/L活性炭的MS培养基；所述初级愈伤诱导培养基为含有1.5～2.5mg/L 6
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BA和0.1～0.5mg/L NAA的MS培养基；所述胚性增殖培养基为含有0.5～1.0mg/L 6
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BA和0.1～0.5mg/L 2,4
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D的MS培养基。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述抑制茎尖玻璃化培养基为含有0.03mg/L TDZ、0.05mg/L NAA、0.4mg/L抗坏血酸、0.4mg/L PVP和2.5g/L活性炭的MS培养基；所述初级愈伤诱导培养基为含有1.5mg/L 6
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BA和0.1mg/L NAA的MS培养基；所述胚性增殖培养基为含有1.0mg/L 6
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BA和0.5mg/L 2,4
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D的MS培养基。3.权利要求1或2所述的培养基在草果组织培养中的应用。4.草果组织培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：将草果幼嫩茎尖作为外...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉训志，秦晓威，郝朝运，吴莲张，和俊才，王灿，谷风林，徐飞，闫林，李有丽，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院香料饮料研究所，
类型：发明
国别省市：