一种从Raffaelealauricola中提取藿烷型三萜类化合物的方法技术

本发明专利技术公开了一种从Raffaelea lauricola中提取藿烷型三萜类化合物的方法，包括：活化菌株，初级培养，次级培养，菌体研磨，乙酸乙酯萃取，浓缩得粗提物，将粗提物进行反相硅胶柱层析，以甲醇：水梯度洗脱，再通过多次200

【技术实现步骤摘要】
一种从Raffaelea lauricola中提取藿烷型三萜类化合物的方法


[0001]本专利技术涉及一种从Raffaelea lauricola中提取藿烷型三萜类化合物的方法。

技术介绍

[0002]Raffaelea lauricola是食菌小蠹（Ambrosia beetle）所携带的高致病性伴生真菌，该病原真菌可致使树木枯萎，各国学者长期致力于其致病机理的研究，随着研究的不断深入，在该属其他物种中已分离获得一些抑制植物生长、抗菌等活性物质，这彰显出该菌在生物农药或医药上有极大应用前景。
[0003]A'
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Neogammacerane
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15α,22
‑
diol是藿烷型三萜类物质，而藿烷型三萜类物质大多有抗肿瘤、抗炎和抗菌等活性。可借助修饰A'
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Neogammacerane
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15α,22
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diol的结构进而获得多种新的活性物质。目前，尚未见在Raffaelea lauricola中分离出A'
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Neogammacerane
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15α,22
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diol的报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是公开一种从Raffaelea lauricola中提取藿烷型三萜类化合物的方法，以促进其进一步在医药领域的研究和开发，为人类造福。
[0005]本专利技术采取的技术方案如下：一种从Raffaelea lauricola中提取藿烷型三萜类化合物的方法，包括以下步骤：1）将Raffaelea lauricola活化后，取菌块接种到PDB 培养基中，在160～180r/min、20~28℃条件下连续培养5~10天，按15wt%~20wt%接种量转接到改良的大米培养基中，继续在20～28℃条件下静置培养28～40天，得到菌丝体；2）将步骤1）得到的菌丝体在35~40℃下干燥后研磨成粉状，用1~2倍体积的乙酸乙酯浸泡12~24小时，超声40~60分钟，收集萃取液，残渣中再加入菌丝体1~2倍体积的乙酸乙酯，超声40~60分钟，收集萃取液，重复以上步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏；3）将浸膏用氯仿或二氯甲烷溶解，然后用反相硅胶C
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进行拌样，干法装柱，以甲醇：水自体积比1:9
→
9:1梯度洗脱，收集甲醇：水体积比为9:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得组分A；4）用1倍体积的氯仿溶解组分A，过200
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300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比为30:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，再过200
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300目硅胶柱，以石油醚：氯仿体积比为8:1开始梯度洗脱，收集石油醚:氯仿体积比为4:1部分洗脱液，再过200
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300目硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯体积比为20:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为6:1部分洗脱液，旋蒸得到白色粉末状藿烷型三萜类化合物A'
‑
Neogammacerane
‑
15α,22
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diol，结构如下所示：
。
[0006]进一步地，所述步骤1）中改良的大米培养基：大米100g，木屑10g，加入纯水120 mL，121℃高压灭菌20min备用。
[0007]进一步地，所述步骤1）中接种菌块的大小为0.5
×
0.5cm，接种量为4 块。
[0008]进一步地，所述步骤2）中超声的功率为400 W，频率为35 KHz。
[0009]进一步地，所述步骤3）中使用的反相硅胶C
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粒径40
‑
60μm，孔径120
Å
。
[0010]进一步地，所述步骤3）中梯度洗脱比例为甲醇：水体积比1:9, 2:8,3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2,9:1。
[0011]进一步地，所述步骤4）中梯度洗脱比例为石油醚：乙酸乙酯体积比30:1,20:1,10:1,8:1,6:1，石油醚：氯仿体积比8:1,6:1,4:1。
[0012]本专利技术的显著优点：（1）分离纯化简单，成本低；（2）过程简便，易操作；（3）制得的化合物纯度高，且重复性好。
附图说明
[0013]图1为A'
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Neogammacerane
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15α,22
‑
diol化合物的1H NMR谱（CDCl3）；图2为A'
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Neogammacerane
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15α,22
‑
diol化合物的
13
C NMR谱（CDCl3）；图3为A'
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Neogammacerane
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15α,22
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diol化合物的DEPT135谱（CDCl3）；图4为A'
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Neogammacerane
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15α,22
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diol化合物的COSY谱（CDCl3）；图5为A'
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Neogammacerane
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15α,22
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diol化合物的HMBC谱（CDCl3）；图6为A'
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Neogammacerane
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15α,22
‑
diol化合物的HSQC谱（CDCl3）。
具体实施方式
[0014]为让本专利技术的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，作详细说明。本专利技术的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。
[0015]本专利技术所使用的Raffaelea lauricola菌株编号为Hulcr7161。
[0016]实施例11)取Raffaelea lauricola为材料，无菌条件下挑取大小为0.5
×
0.5cm的菌块4块接种到PDB培养基（马铃薯葡萄糖粉3.9g,纯水100 mL，装入250mL锥形瓶，在121℃高压下灭菌20min）中，在160r/min、25℃条件下连续培养7天即初级培养，按10wt%接种量转接到改良的大米培养基（大米100g,木屑10g,加入纯水120 mL，121℃高压灭菌20min）中，继续在25℃条件下静置培养35天即次级培养。
[0017]2)收集培养35天后得到的菌丝体在室温下干燥之后研磨粉碎，加1倍体积的乙酸
乙酯浸泡12小时，超声40分钟，过滤得萃取液，残渣中再加入菌丝体1倍体积的乙酸乙酯，超声40分钟，收集萃取液，再次重复上述步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏。
[0018]3)将浸膏溶解于氯仿，使用40
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60μm粒径反相C
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硅胶拌样，干法装柱，以甲醇：水自1:9体积比开始梯度洗脱（甲醇：水体积比本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从Raffaelea lauricola中提取藿烷型三萜类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将Raffaelea lauricola活化后，取菌块接种到PDB 培养基中，在160～180r/min、20~28℃条件下连续培养5~10天，按15wt%~20wt%接种量转接到改良的大米培养基中，继续在20～28℃条件下静置培养28～40天；2）将步骤1）得到的菌丝体在35~40℃下干燥后研磨成粉状，用1~2倍体积的乙酸乙酯浸泡12~24小时，超声40~60分钟，收集萃取液，残渣中再加入菌丝体1~2倍体积的乙酸乙酯，超声40~60分钟，收集萃取液，重复以上步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏；3）将浸膏用氯仿或二氯甲烷溶解，然后用反相硅胶C
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进行拌样，干法装柱，以甲醇：水自体积比为1:9梯度洗脱，收集甲醇：水体积比为9:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得组分A；4）用1倍体积的氯仿溶解组分A，过200
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300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比为30:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，再过200
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300目硅胶柱，以石油醚：氯仿体积比为8:1开始梯度洗脱，收集石油醚:氯仿体积比为4:1部分洗脱液，再过200
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300目硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯体积比为20:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为6:...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱君志，谭震，朱志强，赖芃宇，杨晨杰，陈金慧，任冠儒，刘森，陈宇熹，蒲慧丽，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：