一种使用混合吸附色谱分离纯化贻贝粘蛋白的方法技术

本发明专利技术属于蛋白质纯化方法技术领域，尤其涉及一种使用混合吸附色谱分离纯化贻贝粘蛋白的方法，针对蛋白质收率低的问题，现提供以下的方案，包括如下的步骤：(1)破胞沉淀:贻贝粘蛋白工程菌发酵培养后，收集发酵液，破胞，离心，收集沉淀；(2)酸提：在步骤(1)的沉淀中加入酸，搅拌，离心，取上清液；(3)除杂过滤：在步骤(2)的上清液中加盐至终浓度为1M

【技术实现步骤摘要】
一种使用混合吸附色谱分离纯化贻贝粘蛋白的方法


[0001]本专利技术涉及一种蛋白质纯化方法，尤其涉及一种使用混合吸附色谱分离纯化贻贝粘蛋白的方法。

技术介绍

[0002]贻贝粘蛋白(MusselAdhesiveProtein，MAP)，也叫紫贻贝足丝蛋白(Mytilusedulisfootprotein，Mefp)来自海洋贝类紫贻贝，Mytilusedulis，它有在近海耐受波浪影响的能力，它在特殊腺体内生成和储存一种蛋白胶，通过足丝释放到岩石一类的固体表面上，形成抗水的结合，从而将自己固定。在玻璃上的研究显示，蛋白胶形成了斑，从斑延伸开，有很强的抗张强度(106
‑
107newton
·
meter
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2)，而斑内物质包含了贻贝粘蛋白MAP。
[0003]贻贝粘蛋白含有L
‑
3，4
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二羟基苯丙氨酸(L
‑
Dopa)，它由酪氨酸酶对酪氨酸残基的作用形成。L
‑
DOPA残基由于氧化反应而相互交联，交联反应导致了贻贝和特殊表面纤维内强而持久的胶接，其生物粘附的机理很有趣。贻贝粘蛋白粘附对人没有毒性和免疫原性，结合能力和寿命不受水的影响，作为医用手术尤其是眼科手术胶已经引起注意。
[0004]全世界每年进行1100万例白内障手术，我国白内障的发病率非常高，50岁以上人群中白内障发病率29.64％，70岁以上人群发病率高达60％。随着社会老龄化的加剧，这一数字还会上升。目前医生可以用两种闭和方式结束眼科手术：让伤口自行愈合或是用尼龙线缝合切口，每种闭合方法都各有缺点：自愈有感染和眼内液体泄露的危险；缝合会有感染发炎及血管发育异常的危险。而贻贝粘蛋白能在低浓度下交联，并形成可注射到不规则形状部位的低粘性液体，这种溶液可凝固而填充到指定空间，在几分钟内可封闭切口，少于缝合所需时间。贻贝粘蛋白还形成了一个不可破坏的封条，在大于正常人眼压12倍的压力下不会使眼内液体发生泄露。贻贝粘蛋白具有和眼角膜近似的折射率，不会干扰光线到达视网膜。
[0005]另外，贻贝粘蛋白的生物降解性质使其对环境很友好，也可用于其他领域，如通用的生化粘接试剂、医用组织粘接及密封剂，医用愈伤基质，牙医粘接和密封剂，医用设备表面涂层试剂，水下作业设备涂层等。
[0006]贻贝粘蛋白纯化通常将以下技术组合应用：提取、盐析、示差沉淀、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、反相色谱、亲和色谱和分子排阻色谱，但活性蛋白质收率低仅为15％。工艺复杂，规模制备成本高、周期长，对pH值和盐浓度敏感而导致稳定性难控制，有必要研究新的色谱方法获取高纯度、高活性的贻贝粘蛋白。
[0007]贻贝粘蛋白由于L
‑
3，4
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二羟基苯丙氨酸(L
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DOPA)的含量高达11％而富含多酚基团被认为是多酚蛋白质。L
‑
DOPA在胶纤维形成过程中的反应性暴露在表面，其酚羟基是氢键供体，可使用包含适当氢键受体吸附剂的氢键色谱进行分离；其苯环结构可形成疏水键，说明书
[0008]CN101348518B2/4页5可利用疏水相互作用进行分离；其赖氨酸氨基的正电荷，可
形成静电键。可利用贻贝粘蛋白结构中的这些特点，以上述氢键吸附、疏水作用、静电吸附三种原理进行分离。
[0009]蛋白质这类生物药物或生物医学材料的分离纯化主要通过色谱技术及其组合，所用介质材料主要是凝胶过滤、离子交换、疏水相互作用、亲和、反相介质，其基质材料有琼脂糖、葡聚糖、聚苯乙烯和硅胶等。琼脂糖介质是目前生物医药研发和生产中使用最为普遍的规模制备用分离介质，该基质具有高孔度(90
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96％)，即使在高浓度下也能保持高的孔度；具有连接纤维的开放的结构；高的连通性有效保证了分子内物质传递；大比表面积可提供了很高的吸附能力易制备成不同琼脂糖浓度、不同尺寸的球形颗粒以满足不同领域的需求；在氢氧化钠中稳定可满足苛刻的在位清洗步骤；低的非特异性吸附使应用面较广；具有弹性及非脆性(较易实现柱子的再装填)又可通过足够的交联步骤使介质具有刚性(有较高的耐压性能)；可用不同的活化步骤进行共价交联而活化，可被大量配基取代而应用于多种吸附色谱技术。本专利技术所涉及分离纯化的核心技术采用琼脂糖基质介质。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的在于克服使用传统方法纯化贻贝粘蛋白收率低的问题，采用混合吸附色谱，即氢键吸附、疏水吸附、静电吸附三种原理的吸附色谱，提供一种高选择性、高收率的贻贝粘蛋白分离纯化方法，简化工艺，降低成本。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0012]一种使用混合吸附色谱分离纯化贻贝粘蛋白的方法，包括如下的步骤：
[0013](1)破胞沉淀:贻贝粘蛋白工程菌发酵培养后，收集发酵液，破胞，离心，收集沉淀；
[0014](2)酸提：在步骤(1)的沉淀中加入酸，搅拌，离心，取上清液；
[0015](3)除杂过滤：在步骤(2)的上清液中加盐至终浓度为1M
‑
3M，离心，取上清液；
[0016](4)去除小分子化合物，用SephadexG
‑
25或SephadexG
‑
50去除步骤(3)中的小分子化合物，流动相为pH2.0
‑
6.0的10mM
‑
80mM的醋酸钠缓冲液，添加0.1M
‑
0.6M氯化钠，收集穿透峰；
[0017](5)将步骤(4)中得到的溶液浓缩馏分；
[0018](6)洗脱：采用离子交换介质进行线性梯度洗脱；
[0019](7)采用SuperdexG200或Bio
‑
GelA凝胶过滤介质，以0.1M
‑
0.6M氯化钠和0.5％
‑
4％柠檬酸或1％
‑
5％乙酸为流动相对步骤(6)的溶液进行过滤；
[0020](8)将步骤(7)中得到的溶液浓缩馏分；
[0021](9)酸性条件下进行低温保存；
[0022](10)鉴定贻贝粘蛋白的蛋白质分子量；
[0023](11)将贻贝粘蛋白进行特异性染色；
[0024](12)用C8反相键合相硅胶色谱柱分析贻贝粘蛋白纯度：C8色谱柱4.6mm
×
250mm，5μm,300A，以乙腈
‑
水(15:85)为流动相等度洗脱，280nm检测。
[0025]优选的，步骤(1)中：所述破胞的方法为：在发酵液中加入非离子型表面活性剂，搅拌破胞；搅拌破胞的温度为60℃～85℃，时间为20min～40min；所述离心的速度为10000r/min～16000r/min。
[0026]优选的，步骤(2)中：取1％
‑
3.5％高氯酸或/和1％
‑
10％乙酸为提取溶剂，取100g
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种使用混合吸附色谱分离纯化贻贝粘蛋白的方法，其特征在于，包括如下的步骤：(1)破胞沉淀:贻贝粘蛋白工程菌发酵培养后，收集发酵液，破胞，离心，收集沉淀；(2)酸提：在步骤(1)的沉淀中加入酸，搅拌，离心，取上清液；(3)除杂过滤：在步骤(2)的上清液中加盐至终浓度为1M
‑
3M，离心，取上清液；(4)去除小分子化合物，用Sephadex G
‑
25或Sephadex G
‑
50去除步骤(3)中的小分子化合物，流动相为pH2.0
‑
6.0的10mM
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80mM的醋酸钠缓冲液，添加0.1M
‑
0.6M氯化钠，收集穿透峰；(5)将步骤(4)中得到的溶液浓缩馏分；(6)洗脱：采用离子交换介质进行线性梯度洗脱；(7)采用SuperdexG200或Bio
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GelA凝胶过滤介质，以0.1M
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0.6M氯化钠和0.5％
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4％柠檬酸或1％
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5％乙酸为流动相对步骤(6)的溶液进行过滤；(8)将步骤(7)中得到的溶液浓缩馏分；(9)酸性条件下进行低温保存；(10)鉴定贻贝粘蛋白的蛋白质分子量；(11)将贻贝粘蛋白进行特异性染色；(12)用C8反相键合相硅胶色谱柱分析贻贝粘蛋白纯度：C8色谱柱4.6mm
×
250mm，5μm,300A，以乙腈
‑
水(15:85)为流动相等度洗脱，280nm检测。2.根据权利要求1所述的一种使用混合吸附色谱分离纯化贻贝粘蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中：所述破胞的方法为：在发酵液中加入非离子型表面活性剂，搅拌破胞；搅拌破胞的温度为60℃～85℃，时间为20min～40min；所述离心的速度为10000r/min～16000r/min。3.根据权利要求1所述的一种使用混合吸附色谱分离纯化贻贝粘蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中：取1％
‑
3.5％高氯酸或/和1％
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10％乙酸为提取溶剂，取100g贻贝足丝加300ml
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1000ml提取溶剂，10℃
‑
25℃浸提15min
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30min，使用搅拌器以10000r/min
‑
16000r/min离心30min
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50min或以40μm滤膜过滤去除残渣，保留上清液。4.根据权利要求1所述的一种使用混合吸附...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淑媛，
申请(专利权)人：湖南博润达医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：