用于检测碱基编辑器编辑位点的方法和试剂盒技术

本申请涉及一种用于检测碱基编辑器编辑核酸的位点的方法，以及用于实施所述方法的试剂盒。本申请还涉及用于检测碱基编辑器编辑核酸的编辑效率或脱靶效应的方法。酸的编辑效率或脱靶效应的方法。酸的编辑效率或脱靶效应的方法。

【技术实现步骤摘要】
用于检测碱基编辑器编辑位点的方法和试剂盒


[0001]本申请涉及基因编辑(特别是碱基编辑)
具体而言，本申请涉及一种用于检测碱基编辑器(例如单碱基编辑器或双碱基编辑器)编辑核酸的位点的方法，以及用于实施所述方法的试剂盒。本申请还涉及用于检测碱基编辑器(例如单碱基编辑器或双碱基编辑器)编辑核酸的编辑效率或脱靶效应的方法。

技术介绍

[0002]2016年David Liu等在CRISPR/Cas9系统的基础上将来自大鼠的rAPOBEC1与nCas9(D10A)蛋白相融合，研发出了胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor,CBE)(Komor,et al.Nature 533,420
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424,doi:10.1038/nature17946(2016))。其设计的编辑原理为：首先，失去部分核酸切割活性的nCas9依然能为sgRNA所引导，带动与nCas9相连的rAPOBEC1至目标靶向位点处；随后，sgRNA会与目的基因的DNA序列形成R环(R
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loop)结构，从而使得R环中处于单链状态的非sgRNA互补链DNA(non
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target strand)能够被APOBEC1所结合，将该链上一定范围内的胞嘧啶(C)脱氨成尿嘧啶(U)；最后，这些尿嘧啶便可通过后续的DNA复制过程完成尿嘧啶至胸腺嘧啶的转换，从而最终实现C至T(C
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to
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T)的碱基转换。此后，编辑效率、活性编辑窗口、可编辑序列范围等各方面得到不同程度的优化的多种新的CBE编辑系统也相继被开发出来，例如YE1
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BE，BE4max等(Kim,Y.B.et al.Nature biotechnology 35,371
‑
376,doi:10.1038/nbt.3803(2017)；Suzuki,K.et al.Nature 540,144
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149,doi:10.1038/nature20565(2016))。
[0003]此外，2020年David Liu等报导了一种RNA
‑
free的线粒体胞嘧啶碱基编辑器DdCBE(DddA
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derived CBE)，其实现了线粒体基因编辑的重大突破(Mok,B.Y.et al.Nature 583,631
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+,doi:10.1038/s41586
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020
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2477
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4(2020))。此前，由于线粒体双层膜的存在，将sgRNA导入线粒体仍然面临极大的挑战，严重限制了基于CRISPR/Cas9的CBE工具在线粒体基因编辑方面的应用。相对于基于CRISPR/Cas9的CBE工具，DdCBE的主要改变包括以下两点：一是用TALE蛋白代替sgRNA，实现对靶向DNA链的识别，避免了sgRNA难以进入线粒体的难题；二是用新发现的一种双链DNA脱氨酶DddA代替APOBEC，将靶向位点处双链DNA上的dC脱氨转变为dU，最终实现dC至dT的碱基转变。
[0004]综上，已有多种针对细胞核或者线粒体的胞嘧啶碱基编辑系统，并且还在不断的丰富中。但其核心原理均为，在靶向的编辑位点使胞嘧啶(C)脱氨成尿嘧啶(U)；最后，这些尿嘧啶便可通过后续的DNA复制过程完成尿嘧啶(U)至胸腺嘧啶(T)，从而最终实现C至T(C
‑
to
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T)的碱基转换。
[0005]自2016年David Liu发展了胞嘧啶碱基编辑器(Komor et al.,2016)后，2017年腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor，ABE)(Gaudelli et al.,2017)也随即问世，该技术的主要编辑原理为：Cas9在sgRNA的引导下到达靶向编辑位点，打开DNA双链形成R
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loop结构，随后与Cas9融合在一起的腺嘌呤脱氨酶会将编辑窗口内的腺嘌呤脱氨形成次黄嘌呤(inosine,I)。在修复以及复制过程中，次黄嘌呤将被DNA聚合酶读成G，从而最终发生腺嘌
呤(A)到鸟嘌呤(G)的转变。经过几年的发展，目前使用率较高的是ABEmax系统，此系统基于最初ABE版本进行了突变筛选、密码子优化及引入核定位信号等一系列改进，使得靶向位点的编辑效率不断提高。2020年，David Liu和Jennifer A.Doudna又新报道了一种具有更高活性的ABE版本，并命名为ABE8e(Richter et al.,2020)。ABE8e在ABEmax的基础上只保留一个TadA元件，且进行了多个突变，不仅提高了酶的体外活性(Lapinaite et al.,2020)，且在细胞内的靶向位点的编辑效率也得到了很大的提升。
[0006]同样，类似于CBE编辑系统，目前开发出了多种ABE编辑系统，其核心原理均为，在靶向编辑位点使腺嘌呤脱氨成次黄嘌呤；之后，这些次黄嘌呤便可通过后续的DNA复制过程完成次黄嘌呤至鸟嘌呤，从而最终实现腺嘌呤(A)到鸟嘌呤(G)(A
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to
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G)的碱基转换。
[0007]此外，在2020年相继有四个课题组发展了腺嘌呤与胞嘧啶双碱基编辑系统(ACBE)(Grunewald et al.,2020；Li et al.,2020；Sakata et al.,2020；Zhang et al.,2020)，基本原理是将此前发展的ABE和CBE技术联合，实现对同一个靶向编辑窗口内部的腺嘌呤和胞嘧啶进行同时编辑。
[0008]理想的基因编辑工具按设计应该只会对目的靶向位点进行编辑，但实际上不论是ZFN/TALEN还是CRISPR/Cas系统一直以来都被发现具有脱靶风险。所谓脱靶，即是所使用的基因编辑工具在非靶标位置进行了不必要的编辑。脱靶事件一经发生，便可能会破坏该处的基因序列或染色体结构，扰乱基因组稳定性和细胞正常功能，进而可能引发各种严重的副作用，甚至诱发癌症。故而，脱靶效应对于那些对基因编辑效果的安全性要求较高的应用(比如临床治疗相关的应用)而言是基因编辑技术的一大致命缺点。如若需将碱基编辑器应用于实际，其脱靶效应必须事先进行彻底、全面且准确的检测评估。
[0009]理论上要检测碱基编辑器的脱靶效应，最简单直接的办法就是通过全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)直接检测出由碱基编辑器产生的单核苷酸突变。但众所周知WGS具有很多自身方法限制：一是基因组中天然存在很多的单核苷酸变异(single nucleotide variations,SNVs)，DNA复制过程以及后期高通量测序过程也会产生不少的随机误差，这些都会造成影响检测准确性的基因组背景(genomic background)，使得WGS在检测单核苷酸突变方面灵敏度极低；二是使用高通量测序技术对全基因组进行WGS测序时，其测序读段(reads)的覆盖度(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测碱基编辑器编辑靶核酸的编辑位点、编辑效率或脱靶效应的方法，其包含下述步骤：(1)提供碱基编辑器编辑靶核酸的编辑产物，其包含碱基编辑中间体，所述碱基编辑中间体包含第一核酸链和第二核酸链；其中，所述第一核酸链包含因所述碱基编辑器编辑靶核酸而生成的编辑碱基；(2)在所述第一核酸链中，在包含所述编辑碱基的区段内(例如，在所述编辑碱基的上游10nt至下游10nt的区段内)产生单链断裂切口；(3)在所述单链断裂切口处或其下游引入经第一标记分子标记的核苷酸，产生含有第一标记分子的标记产物；(4)分离或富集所述标记产物；例如，使用能够特异性识别和结合所述第一标记分子的第一结合分子来分离或富集所述标记产物；(5)测定所述标记产物的序列；从而，确定所述碱基编辑器编辑靶核酸的编辑位点、编辑效率或脱靶效应；优选地，所述碱基编辑器为单碱基编辑器或双碱基编辑器。2.权利要求1的方法，其中，所述碱基编辑器为胞嘧啶碱基编辑器，腺嘌呤碱基编辑器，或腺嘌呤与胞嘧啶双碱基编辑器。3.权利要求1或2的方法，其中，所述靶核酸为基因组核酸或线粒体核酸。4.权利要求1
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3任一项的方法，其中，所述编辑产物是所述碱基编辑器在细胞外、在细胞内或者在细胞器(例如细胞核或线粒体)内编辑靶核酸的产物。5.权利要求1
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4任一项的方法，其中，所述方法在步骤(1)之前还包括如下步骤：在允许所述碱基编辑器编辑靶核酸的条件下，将所述碱基编辑器与所述靶核酸接触，从而生成编辑产物；优选地，在允许所述碱基编辑器编辑靶核酸的条件下，在细胞外、在细胞内或者在细胞器(例如细胞核或线粒体)内，将所述碱基编辑器与所述靶核酸接触，从而生成编辑产物；例如，所述方法在步骤(1)之前还包括如下步骤：将所述碱基编辑器导入细胞内或者细胞器内，使得所述碱基编辑器与细胞内或者细胞器内的靶核酸接触并进行碱基编辑，从而生成编辑产物；或者，将编码所述碱基编辑器的核酸分子导入细胞内或者细胞器内并使其表达所述碱基编辑器，所述碱基编辑器与细胞内或者细胞器内的靶核酸接触并进行碱基编辑，从而生成编辑产物；优选地，在步骤(1)中，从所述细胞内或者细胞器内提取或分离经碱基编辑的靶核酸，并任选地，进行片段化，从而获得所述编辑产物；优选地，在步骤(1)中，从所述细胞内或者细胞器内提取或分离经碱基编辑的靶核酸，并进行核酸片段化和末端修复(例如，5
’
末端悬突的补平和/或3
’
末端悬突的切除)，从而获得所述编辑产物；优选地，所述第二核酸链未发生碱基编辑或不含有编辑碱基；优选地，所述编辑碱基选自尿嘧啶或次黄嘌呤。6.权利要求1
‑
5任一项的方法，其中，步骤(2)中，在所述编辑碱基的位置处或其上游(例如上游10nt内)或下游(例如，下游10nt内)产生单链断裂切口；优选地，在进行步骤(2)之前，所述方法还包括：修复所述编辑产物中可能存在的单链
断裂(SSB)(例如内源性单链断裂)的步骤；例如，在进行步骤(2)之前，所述方法还包括：使用核酸聚合酶、核苷酸(例如不含有标记的核苷酸)和核酸连接酶来修复所述编辑产物中可能存在的SSB(例如内源性SSB)；优选地，在步骤(2)中，使用核酸内切酶(例如，核酸内切酶V，核酸内切酶VIII或AP核酸内切酶)在所述第一核酸链中产生单链断裂切口。7.权利要求1
‑
6任一项的方法，其中，所述经第一标记分子标记的核苷酸选自，经第一标记分子标记的尿嘧啶脱氧核糖核苷酸(例如经第一标记分子标记的dUTP)，经第一标记分子标记的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(例如经第一标记分子标记的dCTP)，经第一标记分子标记的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(例如经第一标记分子标记的dTTP)，经第一标记分子标记的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(例如经第一标记分子标记的dATP)，经第一标记分子标记的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸(例如经第一标记分子标记的dGTP)，或其任何组合；优选地，所述经第一标记分子标记的核苷酸为经第一标记分子标记的尿嘧啶脱氧核糖核苷酸(例如经第一标记分子标记的dUTP)或经第一标记分子标记的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸(例如经第一标记分子标记的dGTP)；优选地，所述第一标记分子与所述第一结合分子构成了能够发生特异性相互作用(例如，能够特异性相互结合)的分子对；例如，所述第一标记分子为生物素或其功能性变体，且所述第一结合分子为亲和素或其功能性变体；或者，所述第一标记分子为半抗原或抗原，且所述第一结合分子为特异性抗所述半抗原或抗原的抗体；或者，所述第一标记分子为含炔基基团(例如乙炔基)，且所述第一结合分子为能与所述炔基发生点击化学反应的叠氮基化合物；例如，所述经第一标记分子标记的核苷酸为含有乙炔基的核苷酸(例如，5
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Ethynyl
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dUTP)，且所述第一结合分子为能与所述乙炔基发生点击化学反应的叠氮基化合物(例如叠氮基修饰的磁珠)；优选地，通过核酸聚合反应将所述经第一标记分子标记的核苷酸引入在所述单链断裂切口处或其下游，从而产生含有第一标记分子的标记产物；例如，在步骤(3)中，使用核酸聚合酶(例如，具有链置换活性的核酸聚合酶)将所述经第一标记分子标记的核苷酸引入在所述单链断裂切口处或其下游；优选地，在步骤(3)中，在所述单链断裂切口处或其下游还引入经第二标记分子标记的核苷酸，从而产生含有第一标记分子和第二标记分子的标记产物；优选地，所述经第二标记分子标记的核苷酸是这样的核苷酸分子，其在不同的条件下(例如，经历处理前后)能够与不同的核苷酸进行碱基互补配对；例如，所述含有第二标记的核苷酸分子选自5
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醛基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸，5
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羧基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸，5
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羟甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸，和N4
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乙酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸；例如，所述经第二标记分子标记的核苷酸为5
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醛基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸；优选地，通过核酸聚合反应将所述经第二标记分子标记的核苷酸引入在所述单链断裂切口处或其下游。8.权利要求1
‑
7任一项的方法，其中，在步骤(2)中，在所述编辑碱基的位置处产生单链断裂切口；并且，在步骤(3)中，在所述单链断裂切口处及其下游引入所述经第一标记分子标记的核苷酸和所述经第二标记分子标记的核苷酸，产生含有第一标记分子和第二标记分子的标记产物；
优选地，在步骤(3)之后，对标记产物进行处理，以改变其包含的经第二标记分子标记的核苷酸的碱基互补配对能力；例如，所述经第二标记分子标记的核苷酸为5
‑
醛基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸，并且，在步骤(3)之后，用化合物(例如丙二腈，硼烷类化合物(例如吡啶硼烷类化合物，例如吡啶硼烷或2
‑
甲基吡啶硼烷)，或叠氮茚二酮)对标记产物进行处理，以改变其包含的5
‑
醛基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的碱基互补配对能力；例如，所述经第二标记分子标记的核苷酸为5
‑
羧基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸，并且，在步骤(3)之后，用化合物(例如硼烷类化合物(例如吡啶硼烷类化合物，例如吡啶硼烷或2
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甲基吡啶硼烷))对标记产物进行处理，以改变其包含的5
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羧基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的碱基互补配对能力；例如，所述经第二标记分子标记的核苷酸为5
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羟甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸，并且，在步骤(3)之后，所述标记产物先用氧化剂(例如钌酸钾)或氧化酶(例如，TET(ten
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eleven translocation)蛋白)进行处理，再用化合物(例如丙二腈，硼烷类化合物(例如吡啶硼烷类化合物，例如吡啶硼烷或2
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甲基吡啶硼烷)，或叠氮茚二酮)进行处理，以改变其包含的5
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羟甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的碱基互补配对能力；例如，所述经第二标记分子标记的核苷酸为N4
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乙酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(dac4C)，并且，在步骤(3)之后，用化合物(例如氰基硼氢化钠)对标记产物进行处理，以改变其包含的N4
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乙酰基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的碱基互补配对能力；优选地，对标记产物的处理步骤在对标记产物进行测序之前进行，例如，在步骤(4)之前或在步骤(5)之前进行；优选地，在步骤(3)之前(例如，在步骤(2)之前)，对编辑产物进行中可能存在的经第二标记分子标记的核苷酸进行保护(例如，使用乙基羟胺保护内源性的5
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醛基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸，或者，使用βGT催化的糖基化反应保护内源性的5
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羟...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊成器，雷芷芯，孟浩巍，吕志聪，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：