一种抗体的纯化方法技术

本申请提供了一种抗体的纯化方法，包括如下步骤：将待处理样品进行深层过滤和亲和层析、超滤浓缩和透析。本申请的方法可显著去除宿主蛋白、DNA、以及多聚体等杂质；达到与现有技术中亲和层析、深层过滤、阴离子交换、阳离子交换组合方法相当的纯化效果，同时简化工艺步骤，降低成本，提高样品产率。提高样品产率。提高样品产率。

【技术实现步骤摘要】
一种抗体的纯化方法
专利
：
[0001]本申请属于生物制品领域，具体地，本申请提供了一种抗体纯化方法。

技术介绍
：
[0002]抗体长期以来一直用于研究中，并广泛用于诊断；特别是小鼠血清IgG抗体广泛应用于心血管疾病诊断、肿瘤诊断、传染病诊断等。
[0003]多克隆抗体纯化方法比较多，主要有硫酸铵沉淀、辛酸
‑
硫酸铵沉淀，硫酸铵沉淀
‑
分子筛层析，离子交换层析、疏水层析，ProteinA亲和层析及抗原亲和纯化。由于硫酸铵沉淀中多次涉及到离心且纯化步骤费时，在工业生产上难以放大，且得到的抗体纯度低，特异性差，而分子筛层析规模难以放大，离子交换层析特异性差，需要多步离子层析过程，步骤繁琐，得到的抗体特异性低，抗原亲和纯化需要大量的抗原，难以放大，因此都没有得到广泛的使用。ProteinA亲和层析对抗体的抗体亲和力高，特异性强，操作简单，但是对特定来源的IgG，比如和小鼠的IgG1、IgG2a结合力低。相比于Protein A，Protein G对于大多数哺乳动物的IgG有着更高的亲和力，尤其是对于IgG亚基，如人IgG3，小鼠IgG1和鼠IgG2a，纯化出的IgG组份更全面。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供小鼠血清抗体的纯化方法，以解决现有技术中存在的纯化工艺步骤多，成本高、纯度低等技术问题。
[0005]为了实现专利技术的上述目的，一方面，本申请提供了一种抗体的纯化方法，包括如下步骤：
[0006]将待处理样品进行深层过滤和亲和层析、超滤浓缩和透析。
[0007]进一步地，所述亲和层析纯化包括：使用平衡缓冲液平衡亲和层析柱后上样，采用所述平衡缓冲液、冲洗层析柱至基线平稳，然后采用洗脱缓冲液洗脱目标抗体并收集；
[0008]进一步地，所述平衡缓冲液选自pH7.0～8.0的磷酸缓冲液，Tris缓冲液，pH4.5～5.5的NaAc～HAc缓冲液中的一种；优选地，所述磷酸缓冲液的浓度为10mM～100mM，NaAc～HAc缓冲液的浓度为50
‑
100mM，tris缓冲液的浓度为10mM～100mM。
[0009]进一步地，所述平衡缓冲液选自缓冲液A～缓冲液C中一种：
[0010]缓冲液A：pH7.0
‑
8.0,含50～150mM的NaCl的10～100mM磷酸缓冲液；
[0011]缓冲液B：pH7.0
‑
8.0，含50～150mM的NaCl的10～100mMTris缓冲液；
[0012]缓冲液C:pH4.5～5.5,含50～150mM的NaCl的50～100mM NaAc～HAc缓冲液。
[0013]进一步地，所述洗脱缓冲液选自pH2.5～3.5的甘氨酸缓冲液，pH3.0～4.0柠檬酸钠缓冲液中的至少一种；优选地，所述甘氨酸缓冲液的浓度为50mM～1000mM，柠檬酸缓冲液的浓度为20mM～100mM。
[0014]进一步地，所述洗脱缓冲液选自缓冲液D～缓冲液E中一种：
[0015]缓冲液D：pH2.5～3.5、50mM～1000mM甘氨酸缓冲液；
[0016]缓冲液E：pH3.0～3.5、20mM～100mM柠檬酸钠缓冲液；
[0017]进一步地，调节所述洗脱的线性流速使目的蛋白的保留时间为5～10min。
[0018]进一步地，所述洗脱液的用量为5～8CV；优选地，所述亲和层析的填料为Protein G。
[0019]进一步地，采用pH调节剂调节所述目标抗体洗脱液的pH到7.2～7.6；优选地，所述pH调节剂为Tris缓冲液，缓冲液的浓度为0.5M～1M，缓冲液的pH为8.0～9.0。
[0020]进一步地，所述深层过滤中，采用平衡缓冲液将深层过滤器中的料液置换出。
[0021]进一步地，所述超滤浓缩和透析中使用膜包超滤透析，膜包的材质为PES或再生纤维素；优选地，膜包的分子量为30KD。
[0022]另一方面，本申请还提供了上述方法在诊断试剂、生物原材料，生物大分子制备中的应用。
[0023]本申请中所述待处理样品包括但不限于血液、血浆、血清。
[0024]本申请的方法可用于纯化天然抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段；优选IgG抗体。
[0025]本申请的深层过滤器和超滤膜可以选用各种市售产品，只要其过滤大小、分子量等指标符合本申请的要求即可。
[0026]深层过滤器主要以纤维素纤维加硅藻土等助滤剂做过滤介质。纤维素组成了滤芯中的网状结构，纤维之间的空隙用于捕捉料液中的颗粒，随着过滤的进行，颗粒堆积在表面形成滤饼，会提高过滤的效率。同时随着滤饼越来越厚，也会降低过滤的速度。在纤维中加入硅藻土，可以提高在形成滤饼后的过滤速度。深层过滤介质的第三个组分是树脂，它有2方面的作用，一是粘结纤维，二是提供过滤介质表面的正电荷。这些正电荷可以吸附带负电、比过滤孔径小很多的细胞碎片等杂质。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0027](1)本专利技术的抗体纯化的方法，通过采用深层过滤工艺、配合亲和层析纯化和切向流透析，可显著去除宿主蛋白、DNA、以及多聚体等杂质。达到与现有技术中亲和层析+深层过滤+阴离子交换+阳离子交换相当的纯化效果，同时简化工艺步骤，降低成本，提高样品产率。
[0028](2)采用本专利技术的抗体纯化方法，可使样品SDS
‑
PAGE纯度达到99％以上，符合最终的质量要求。
附图说明
[0029]图1.实施例1不同条件制备的小鼠IgG样品SDS
‑
PAGE检测结果；
[0030]图2.实施例2
‑
4制备的小鼠IgG样品SDS
‑
PAGE检测结果；
[0031]图3.不同厂家亲和层析填料纯化小鼠IgG样品的SDS
‑
PAGE检测结果，Bgl:博格隆，Lx：蓝晓，Hy：汇研，Qc：千纯，TD：天地人和，NW：纳微；
[0032]图4.不同厂家小鼠IgG样品SDS
‑
PAGE检测结果；A：本公司小鼠IgG，B：金斯瑞小鼠IgG，C：原谷小鼠IgG，D：sigma小鼠IgG。
具体实施方式
[0033]下面结合具体实施例详述本专利技术，但本专利技术的保护范围不局限于以下实施例。
[0034]实施例1
[0035]条件A:
[0036](1)用6CV的100mM NaAc～Hac，150mM NaCl pH5.0的平衡缓冲液平衡亲和层析柱，填料为Protein A(赛分科技)，层析柱规格为16
×
25mm，体积5mL。将(1)中得到的样品进行上样，再用15CV的平衡液进行冲洗，最后用0.1M甘氨酸pH3.0进行洗脱，当洗脱液在280nm波长下的紫外值达到50mAU时开始收集，紫外值降低到30mAU时停止收集。
[0037]条件本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗体的纯化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将待处理样品进行深层过滤和亲和层析、超滤浓缩和透析。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲和层析纯化包括：使用平衡缓冲液平衡亲和层析柱后上样，采用所述平衡缓冲液、冲洗层析柱至基线平稳，然后采用洗脱缓冲液洗脱目标抗体并收集。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述平衡缓冲液选自pH7.0～8.0的磷酸缓冲液，Tris缓冲液，pH4.5～5.5的NaAc～HAc缓冲液中的一种；优选地，所述磷酸缓冲液的浓度为10mM～100mM，NaAc～HAc缓冲液的浓度为50
‑
100mM，tris缓冲液的浓度为10mM～100mM。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述平衡缓冲液选自缓冲液A～缓冲液C中一种：缓冲液A：pH7.0
‑
8.0,含50～150mM的NaCl的10～100mM磷酸缓冲液；缓冲液B：pH7.0
‑
8.0，含50～150mM的NaCl的10～100mMTris缓冲液；缓冲液C：pH4.5～5.5,含50～150mM的NaCl的50～100mM NaAc～HAc缓冲液。5.根据权利要求2
‑
4任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液选自pH2.5～3.5的甘氨酸缓冲液，pH3.0～4.0柠檬酸钠缓冲液中的至少一种；优选地，所述甘氨酸缓冲液的浓度为50mM～1000mM，柠檬酸缓冲液的浓度为20mM～10...

【专利技术属性】
技术研发人员：元佳佳，郑冬冬，熊雅琴，
申请(专利权)人：武汉佳惟达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：