NAT15启动子区甲基化水平检测试剂在制备ccRCC预后试剂中的应用制造技术

本发明专利技术涉及NAT15启动子区cg03933495位点甲基化水平检测试剂在制备ccRCC预后试剂中的应用。本发明专利技术找到了一个可用于对ccRCC进行有效而准确预测的差异甲基化位点，并且将其与其他17个差异甲基化位点组合可构建出一个优于当前所有预后方法的针对ccRCC的预后模型，医生可根据该预后模型指示的风险评分为患者提供最适的治疗手段。供最适的治疗手段。供最适的治疗手段。

【技术实现步骤摘要】
NAT15启动子区甲基化水平检测试剂在制备ccRCC预后试剂中的应用


[0001]本专利技术涉及ccRCC的诊断与预后领域，更特别的，涉及NAT15启动子区甲基化水平检测试剂在制备ccRCC预后试剂中的应用。

技术介绍

[0002]NAT15(N
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Acetyltransferase 15)基因编码的蛋白具有酰基转移酶活性，定位于高尔基体，在高尔基体上将乙酰基转移到游离蛋白质的N端。该基因被报道与Scheuermann病、Ogden综合征、肺癌等疾病有关。该基因的启动子区存在24个能够被甲基化的位点。但是，尚未有研究将该基因及其启动子区的甲基化水平与肾透明细胞癌(ccRCC)的诊断和病情进展联系起来。
[0003]肾透明细胞癌(ccRCC)是一种常见的肾细胞癌，占据了肾细胞癌的80％
‑
90％，具有较高的复发率、转移率及死亡率。ccRCC是一种高度异质的肿瘤，具有从缓慢生长的局部肿瘤到向远处转移的侵袭性肿瘤等复杂多变的临床表现。
[0004]目前，ccRCC的预后分析方法包括TNM分级、UISS评分、SSIGN评分以及Leibovich评分，然而这些分级和评分在很大程度上依赖于病理学家的经验与主观判断。
[0005]随着分子生物学技术的发展，越来越多的分子标记被用于疾病的诊断和预后。但是，对于ccRCC而言，还缺少了足够的差异甲基化位点，未能构建出有效的预后模型。因此，需要找到更多与ccRCC预后有关的分子标记，用来构建ccRCC的预后模型。
专利技术内容
[0006]我们在研究中发现，ccRCC的肿瘤组织和癌旁组织之间在NAT15的启动子区中的cg03933495位点存在甲基化差异。我们进一步探索，开发由包括该位点在内的18个差异甲基化位点构成的风险评分模型，并找出了高风险与低风险患者之间的风险评分切值，运用该风险评分模型和切值，可对ccRCC患者的治疗和进展前景进行有效而准确的预测，优于当前所有关于ccRCC的预后方法。
[0007]基于以上工作，本专利技术提供了NAT15启动子区甲基化水平检测试剂在制备ccRCC预后试剂中的应用。
[0008]在一个具体实施方案中，所述NAT15启动子区甲基化水平检测试剂为检测cg03933495位点的甲基化水平的试剂。
附图说明
[0009]图1为ccRCC组织和癌旁组织中cg03933495位点的甲基化率的统计图。
[0010]图2训练集的风险评分，其中，A为患者的风险评分排列和生存状态，B为高风险群体和低风险群体的KM生存曲线，C为风险评分的1年、3年、5年和10年ROC曲线。
[0011]图3测试集的风险评分，其中，A为患者的风险评分排列和生存状态，B为高风险群
体和低风险群体的KM生存曲线，C为风险评分的1年、3年、5年和10年ROC曲线。
[0012]图4为TCGA数据库中所有ccRCC患者的风险评分，其中，A为患者的风险评分排列和生存状态，B为高风险群体和低风险群体的KM生存曲线，C为风险评分的1年、3年、5年和10年ROC曲线。
[0013]图5为基于预后模型和临床症状的诺模图，其中，A为预后模型和临床症状的单变量回归分析，B为预后模型和临床症状的单变量回归分析，C为预测ccRCC患者存活1年、3年、5年和10年可能性的诺模图。
[0014]图6为模型校准和ROC评价，其中，A为高风险群体和低风险群体的KM生存曲线，B为预测ccRCC患者1年、3年、5年和10年OS的诺模图，C
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F为风险评分(黑线)、肿瘤分级诊断(蓝线)、年龄(黄线)、肿瘤组织学分级(绿线)和诺莫评分(红线)在1年(C)、3年(D)、5年(E)和10年(F)的ROC曲线。
具体实施方式
[0015]以下对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。
[0016]1.差异甲基化位点的发现
[0017]招募10个ccRCC患者，获取肿瘤样本，进行基因组DNA提取。使用内切酶MspI酶切基因组DNA，并进行末端修复，然后将酶切产物跑胶分离，选择大小为40
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120bp和120
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220bp的片段，采用ZYMO EZ DNA Methylation
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Goldkit进行Bisulfite处理并进行PCR扩增，构建文库，将合格的文库进行甲基化测序，获得的甲基化测序数据。
[0018]NAT15的启动子区中的cg03933495位点在ccRCC肿瘤组织和癌旁组织之间存在显著的甲基化水平差异，肿瘤组织的甲基化水平比较高，为0.7178，癌旁组织的甲基化水平为0.5056(图1)。因此，该位点的甲基化水平有可能作为ccRCC患者的预后指标。
[0019]2.模型构建
[0020]我们将甲基化测序数据与参考基因组和Lambda DNA比对，计算位点甲基化水平，通过聚类分析和差异甲基化位点分析。得到2261个差异甲基化区域(DMR)，位于启动子区。从2261个DMR中筛选出578个DMR，这578个DMR对应408个450K微阵列上的位点。
[0021]从TCGA
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KIRC数据库获取478例患者的数据，其中319例样本数据作为训练集，159例作为测试集，进行单变量Cox回归分析，研究408个CpG的差异甲基化水平的预后分值，
[0022]通过LASSO回归分析来获得30个关键的差异甲基化CpG，使用逐步回归分析筛选出最终的18个候选差异甲基化CpG，其中恰好包括了前文提到的cg03933495位点。用这18个差异甲基化CpG构建多变量Cox比例风险回归模型，如式I：
[0023][0024]其中，cg03933495位点的coefficient值为
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4.536，valvue of CpG表示该位点的甲基化水平，该位点的风险比(hazard ratio)为0.011，置信区间(95％CI)为0
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0.617。
[0025]3.模型训练
[0026]使用训练集训练上述模型，对每一个患者样本，根据上述模型计算出风险评分。将
风险评分中值作为区分高风险群体和低风险群体的切值(cutoff值)，结果显示中值为2.455(图2A)。分析所有患者的生存状态分布，根据该切值划分的高风险群体和低风险群体分别做成Kaplan
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Meier(KM)生存曲线，结果显示，高风险群体的存活可能性远低于低风险群体，两个群体显示出显著差异(p＜0.0001)(图2B)。进一步地，对风险评分的1年、3年、5年和10年ROC曲线进行绘图，AUC分别为0.788、0.782、0.854和0.854(图2C)，AUC值显示该模型和切值具有较好的预后效果。
[0027]将上述模型和切值运用于测试集，结果与训练集相似。如图3所示，KM生存曲线分析显示，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.NAT15启动子区甲基化水平检测试剂在制备ccRCC预后试剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓琼，王铸，王杰艳，杜野，陈业达，张建文，张颖，梁辉，
申请(专利权)人：深圳市龙华区人民医院，
类型：发明
国别省市：