一种分离兔正常角膜上皮细胞的方法技术

本发明专利技术涉及分离兔正常角膜上皮细胞的方法，包括：将兔角膜转至培养皿中，将所述兔角膜的上皮面朝下置于胰酶中，放入培养箱中进行消化；利用培养液冲洗所述上皮面，收集液体转至离心管中，并在所述离心管中加入含血清的培养液终止消化；向所述培养皿中加入胰酶，将所述上皮面朝下再次消化，加入含血清的培养液，冲洗所述上皮面并收集液体，并将液体转至所述离心管中；对所述离心管中收集到的液体进行离心；弃去离心后的液体的上清液，利用角膜上皮细胞培养基重悬细胞，并置于培养箱培养，以得到分离好的兔正常角膜上皮细胞。本发明专利技术原代分离细胞实验步骤简单，试剂方便易得，细胞数量多，分离纯度高。分离纯度高。分离纯度高。

【技术实现步骤摘要】
一种分离兔正常角膜上皮细胞的方法


[0001]本专利技术涉及细胞生物学
，特别是涉及一种分离兔正常角膜上皮细胞的方法。

技术介绍

[0002]眼睛是人体重要的视觉器官。随着社会发展，眼科疾病(眼表泪液病、无虹膜、感染、瘢痕性类天疱疮等)或眼部外伤(机械伤、化学伤、热烧伤、手术源损伤等)日益增多。角膜是眼睛最前面的透明部分，由外而内依次包括：上皮层、前弹力层(Bowman膜)、基质层、后弹力层(Decemet膜)和内皮层。角膜上皮细胞间以桥粒相互连接，构成致密坚固的质膜，成为角膜的第一道屏障，具有保护眼球，稳定泪膜，维持角膜透明性等功能。
[0003]角膜上皮细胞的培养成功为角膜移植治疗开拓了广阔前景。目前大部分体外药敏或毒性检测研究都是在原代兔角膜上皮细胞的基础上开展。现有的兔角膜上皮细胞的分离培养方法有贴块法和消化法。贴块法培养过程中杂质细胞尤其是成纤维细胞的污染率较高，细胞老化情况严重。消化法目前有用胰酶、DispaseⅡ酶、胶原酶、透明质酸酶等一种或多种混合消化分离细胞，实验步骤多，消化时间长，细胞数量较少。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分离兔正常角膜上皮细胞的方法，其特征在于，包括：获取兔角膜；将兔角膜转至培养皿中，将所述兔角膜的上皮面朝下置于2ml 0.125％胰酶中，放入37℃，5％CO2培养箱中进行消化；利用2ml DMEM/F12原液冲洗所述上皮面，收集液体转至离心管中，并在所述离心管中加入2ml含血清的DMEM/F12培养液终止消化；向所述培养皿中加入2ml 0.125％胰酶，将所述上皮面朝下再次消化20min，加入2ml含血清的DMEM/F12培养液，冲洗所述上皮面并收集液体，并将液体转至所述离心管中；对所述离心管中收集到的液体进行离心；弃去离心后的液体的上清液，利用角膜上皮细胞培养基重悬细胞，并置于37℃，5％CO2培养箱培养；在培养48小时后首次换液，首次换液后每2天更换1次培养液，以得到分离好的兔正常角膜上皮细胞。2.根据权利要求1所述的分离兔正常角膜上皮细胞的方法，其特征在于，所述获取兔角膜，包括：通过耳缘静脉注射空气针处死新西兰大白兔，取正常的眼球组织转移至超净工作台内；在无菌条件下，将所述眼球组织用1
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PBS缓冲液浸泡5min，沿角膜缘取下完整角膜，并将所述完整角膜用PBS缓冲液漂洗1～2次，以得到去除组织表面血迹及细菌的所述兔角膜。3.根据权利要求1所述的分离兔正常角...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈超，熊君，廖聪，
申请(专利权)人：元道生命科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：