一种鼠源的表皮黑色素细胞的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种鼠源的表皮黑色素细胞的制备方法。其中细胞的制备方法包括如下步骤：酶消化分离表皮组织；表皮黑色素细胞原代、传代培养及纯化。实验证实，采用本发明专利技术的方法分离出纯表皮组织，并通过组织分离培养，获得高纯度表皮黑色素细胞。本发明专利技术所用实验材料易于获得，实验方法简便高效，且本发明专利技术通过原代组织培养可获得高纯度的正常黑色素细胞，经形态学观察，符合黑色素细胞特征，细胞纯度达到90％以上。可为进一步研究黑色素转运机制，机体内的相关基因、蛋白及信号通路的调节，提供基础性材料支持。基础性材料支持。基础性材料支持。

【技术实现步骤摘要】
一种鼠源的表皮黑色素细胞的制备方法


[0001]本专利技术涉及细胞组织工程
，特别是涉及一种鼠源的表皮黑色素细胞的制备方法。

技术介绍

[0002]黑色素瘤作为常见的恶性肿瘤，是一种死亡率极高的疾病，属于皮肤癌症之一。黑色素瘤主要起源于皮肤中的黑色素细胞，黑色素细胞决定机体肤色，该细胞的主要生理功能是产生黑素小体，进而形成并转移黑色素，黑素小体对于机体皮肤具有重要的保护作用，可以避免皮肤受到损害。分泌的黑色素具有吸收紫外光，、参与偶联氧化还原反应、清除自由基和离子存储等功能。当皮肤中黑色素的合成代谢出现异常时，机体则会出现恶性黑色素瘤、白癜风、帕金森病、皮肤色素沉着病以及老年斑等可能性疾病。黑色素瘤细胞增长速率快，治愈率低，相关研究在现代医学水平上还存在很多未知，因此，进一步研治恶性皮肤肿瘤疾病丞待完善。
[0003]黑色素细胞作为皮肤癌症疾病中的基础性实验材料，黑色素细胞培养技术方法的建立是实验研究者所关注的。迄今为止，实验者无法在短时间内获得大量生长状态良好的高纯度黑色素细胞，在这种情况下，就需要一种利用组织分离培养，从而获得高纯度表皮黑色素细胞的方法。
[0004]原代培养通过组织分离，利用合适的酶进行组织消化，获得细胞悬液，经过原代、传代培养以及纯化，从而获得高纯度目的细胞。目前人们对于黑色素细胞分化调控机制仍在进一步探索中。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种鼠源的表皮黑色素细胞的制备方法。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]一种鼠源的表皮黑色素细胞的制备方法，包括：
[0008]获取乳鼠的背部皮肤；
[0009]对所述背部皮肤依次进行清洗、剪切、消化分散、冷消、剥离和润洗，得到表皮组织块；
[0010]对所述表皮组织块进行剪碎处理，得到剪碎的表皮组织；
[0011]对所述剪碎的表皮组织进行消化离心和过滤，得到沉淀；
[0012]在所述沉淀中加入5ml MElM培养基，重悬细胞，加入到T25培养瓶中，放入37℃，含5％CO2培养箱中进行培养；
[0013]检测所述T25培养瓶中的细胞融合度，若所述细胞融合度大于等于90％时，对所述T25培养瓶中的细胞进行离心处理，弃上清并进行润洗，润洗后再次弃上清；
[0014]向所述T25培养瓶内加入1ml的胰蛋白酶
‑
EDTA溶液，并置于37℃，5％的CO2温箱
3min后，倒置显微镜进行观察，若观察到细胞回缩，细胞间隙增大，则再向所述T25培养瓶内加入3ml中和液终止消化；
[0015]用吸管反复吹打所述T25培养瓶的瓶底，以使细胞脱落；
[0016]收集细胞悬液，在1000rpm条件下，离心5min，弃上清，得到细胞沉淀；
[0017]将所述细胞沉淀用培养基重悬，重铺到T25培养瓶中进行培养；
[0018]在24h后更换培养基；更换后的培养基中生长出的细胞为表皮黑色素细胞。
[0019]优选地，所述获取乳鼠的背部皮肤，包括：
[0020]获取出生1至3天的健康乳鼠；
[0021]用75％酒精将所述健康乳鼠进行浸泡，以使所述健康乳鼠窒息死亡；
[0022]将死亡后的乳鼠放在超净工作台中，利用眼科剪断头并去掉四肢，并利用眼科镊将背部整块皮肤剥下，得到所述背部皮肤。
[0023]优选地，所述对所述背部皮肤依次进行清洗、剪切、消化分散、冷消、剥离和润洗，得到表皮组织块，包括：
[0024]将所述背部皮肤置于含1％P/S的PBS溶液中，冲洗净血渍；
[0025]利用眼科剪和眼科镊将所述背部皮肤的皮下结缔组织等去除干净；
[0026]利用PBS溶液清洗去除干净后的组织，用眼科剪将组织剪成3mm左右宽的块状皮肤；
[0027]将所述块状皮肤放入50ml离心管中，加入0.25％DispaseⅡ酶消化液，以使消化液浸泡过所述块状皮肤；
[0028]摇晃离心管，使所述块状皮肤松散开，并在4℃的环境下冷消18
‑
20h；
[0029]在超净台内将含酶消化液的所述块状皮肤倒入皿中，用眼科镊轻挑皮肤表皮，将所述块状皮肤的表皮与真皮剥离；
[0030]将剥离完成的表皮组织放入到含PBS溶液的平皿中，润洗两次，得到所述表皮组织块。
[0031]优选地，所述对所述表皮组织块进行剪碎处理，得到剪碎的表皮组织，包括：
[0032]将获得的所述表皮组织块放入平皿中，用眼科剪将表皮组织剪碎，得到所述剪碎的表皮组织。
[0033]优选地，所述对所述剪碎的表皮组织进行消化离心和过滤，得到沉淀，包括：
[0034]在剪碎的表皮组织中加入0.25％的胰蛋白酶，并用5ml移液管将溶液转移到15ml离心管中；
[0035]将所述15ml离心管放入37℃的水浴锅中，消化8min；消化过程中多次摇晃离心管，以使组织碎片与酶结合，消化均匀；
[0036]当消化完成后，加入终止液终止消化，吹打混匀，用75um的网筛进行过滤并收集滤液；
[0037]将所述滤液进行1000rpm离心5min，弃去上清，收集得到所述沉淀。
[0038]优选地，所述在所述沉淀中加入5ml MElM培养基，重悬细胞，加入到T25培养瓶中，放入37℃，含5％CO2培养箱中进行培养之后，还包括：
[0039]培养24h后，更换细胞培养基；
[0040]在更换细胞培养基后，每两天更换新的培养基。
[0041]根据本专利技术提供的具体实施例，本专利技术公开了以下技术效果：
[0042]本专利技术提供了一种鼠源的表皮黑色素细胞的制备方法，包括：获取乳鼠的背部皮肤；对所述背部皮肤依次进行清洗、剪切、消化分散、冷消、剥离和润洗，得到表皮组织块；对所述表皮组织块进行剪碎处理，得到剪碎的表皮组织；对所述剪碎的表皮组织进行消化离心和过滤，得到沉淀；在所述沉淀中加入5ml MElM培养基，重悬细胞，加入到T25培养瓶中，放入37℃，含5％CO2培养箱中进行培养；检测所述T25培养瓶中的细胞融合度，若所述细胞融合度大于等于90％时，对所述T25培养瓶中的细胞进行离心处理，弃上清并进行润洗，润洗后再次弃上清；向所述T25培养瓶内加入1ml的胰蛋白酶
‑
EDTA溶液，并置于37℃，5％的CO2温箱3min后，倒置显微镜进行观察，若观察到细胞回缩，细胞间隙增大，则再向所述T25培养瓶内加入3ml中和液终止消化；用吸管反复吹打所述T25培养瓶的瓶底，以使细胞脱落；收集细胞悬液，在1000rpm条件下，离心5min，弃上清，得到细胞沉淀；将所述细胞沉淀用培养基重悬，重铺到T25培养瓶中进行培养；在24h后更换培养基；更换后的培养基中生长出的细胞为表皮黑色素细胞。本专利技术所用实验材料易于获得，实验方法简便高效，且本专利技术通过原代组织培养可获得高纯度的正常黑色素细胞，经形态学观察，符本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鼠源的表皮黑色素细胞的制备方法，其特征在于，包括：获取乳鼠的背部皮肤；对所述背部皮肤依次进行清洗、剪切、消化分散、冷消、剥离和润洗，得到表皮组织块；对所述表皮组织块进行剪碎处理，得到剪碎的表皮组织；对所述剪碎的表皮组织进行消化离心和过滤，得到沉淀；在所述沉淀中加入5ml MElM培养基，重悬细胞，加入到T25培养瓶中，放入37℃，含5％CO2培养箱中进行培养；检测所述T25培养瓶中的细胞融合度，若所述细胞融合度大于等于90％时，对所述T25培养瓶中的细胞进行离心处理，弃上清并进行润洗，润洗后再次弃上清；向所述T25培养瓶内加入1ml的胰蛋白酶
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EDTA溶液，并置于37℃，5％的CO2温箱3min后，倒置显微镜进行观察，若观察到细胞回缩，细胞间隙增大，则再向所述T25培养瓶内加入3ml中和液终止消化；用吸管反复吹打所述T25培养瓶的瓶底，以使细胞脱落；收集细胞悬液，在1000rpm条件下，离心5min，弃上清，得到细胞沉淀；将所述细胞沉淀用培养基重悬，重铺到T25培养瓶中进行培养；在24h后更换培养基；更换后的培养基中生长出的细胞为表皮黑色素细胞。2.根据权利要求1所述的鼠源的表皮黑色素细胞的制备方法，其特征在于，所述获取乳鼠的背部皮肤，包括：获取出生1至3天的健康乳鼠；用75％酒精将所述健康乳鼠进行浸泡，以使所述健康乳鼠窒息死亡；将死亡后的乳鼠放在超净工作台中，利用眼科剪断头并去掉四肢，并利用眼科镊将背部整块皮肤剥下，得到所述背部皮肤。3.根据权利要求1所述的鼠源的表皮黑色素细胞的制备方法，其特征在于，所述对所述背部皮肤依次进行清洗、剪切、消化分散、冷消、剥离和润洗，得到表皮组织块，包括：将所述背部皮肤置于含1％P/S的PBS溶液中，冲洗净血渍；...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈超，熊君，廖聪，
申请(专利权)人：元道生命科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：