一种可3D打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水材料的制备方法技术

本发明专利技术涉及胶原蛋白生物墨水材料技术领域，具体涉及一种可3D打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水材料的制备方法，包括以下步骤：取新鲜或冰冻牛肌腱用水洗净，切成1

【技术实现步骤摘要】
一种可3D打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水材料的制备方法


[0001]本专利技术涉及胶原蛋白生物墨水材料
，具体涉及一种可3D打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水材料的制备方法。

技术介绍

[0002]机在修复重建外科领域，过去几十年中已经开发了一系列具有生物活性和生物可吸收性的复合材料，如聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、壳聚糖、胶原蛋白和明胶等用于科研和临床工作。但它们较差的力学性能、有限的生物功能和较高的细胞毒性仍是外科应用的挑战。在这些材料中，胶原蛋白因其是人体组织如骨骼、皮肤、血管、韧带、软骨等的天然组成成分，应用范围广而受到广泛的关注和研究，在组织工程应用中被广泛用于构建基质。
[0003]I型胶原蛋白是胶原蛋白家族中的一员，在人体中占总蛋白质的三分之一，占皮肤干重的四分之三，是细胞外基质中最普遍的成分，具有良好的可生物降解性、弱抗原性和优异的生物相容性。I型胶原蛋白由三个多肽链在空间中组成三螺旋结构，每条链的组成是Gly
‑
X
‑
Y序列，其中X和Y代表任意氨基酸，但主要是羟脯氨酸和脯氨酸。胶原蛋白的三螺旋结构使其具有较高的机械强度和良好的生物活性。胶原蛋白三螺旋结构可以进一步通过自组装和交联形成具有更高机械强度和稳定性的纤维结构，并可以通过调节交联度来控制机械强度和降解速率，具有良好的可控性，使其应用范围可以广泛覆盖从较软的脑组织到较硬的骨组织。在材料制备方面，I型胶原蛋白可以相对容易地从动物结缔组织(牛、猪、鸡和鱼类等)中提取，来源多样，存量丰富。常用的提取方法有酸提取法、碱提取法、酶提取法或以上多种方法联合应用，提取方法成熟，适于实验室操作或大规模工业应用。先前报道胶原蛋白的热降解产物明胶的肽链上的伯胺基可被甲基丙烯酰胺(MA)取代，改性后的明胶在光引发剂的存在下可被紫外光交联。作为结构上的类似物，胶原蛋白肽链上的伯氨基理论上也可被MA取代并进行光交联。目前该技术已被证明可行，通过调节胶原浓度、光引发剂添加比例、紫外光强度和暴露时间，可以控制胶原基质的强度，从而适用于不同应用。该项技术使得利用胶原蛋白进行光交联三维(3D)打印成为可能。
[0004]3D打印，或增材制造是一种工艺，该工艺可通过专用3D打印机将生物材料按照预设的3D建模打印出来并固化。在3D建模程序的帮助下，打印机根据文件中包含的信息将待打印的3D模型切分成多层二维(2D)图案，并将这些2D图案依照层的顺序叠加打印，直到全部模型打印完成。3D打印理论上可以打印出任意几何结构，使临床上针对患者的个性化材料制造具有可行性。目前主要的3D打印技术包括挤出式、喷墨式和激光辅助式。挤出式打印依赖机械力或气动力通过喷嘴挤出生物墨水，打印分辨率显著受限于喷头直径、墨水粘度和弹性等，并且对于胶原蛋白生物墨水无法实现边打印边交联，对于较大或较高的结构容易出现坍塌形变现象。喷墨式打印机是用加热或压电的方法以一定的频率将生物墨水通过针头喷洒到平台上形成结构，其要求墨水粘度低，滴到平台上迅速固化。胶原蛋白对温度敏
感，温度升高会显著改变胶原蛋白生物墨水的粘度，且造成具有生物活性的三螺旋结构降解。同时，若生物墨水混合细胞，细胞在静置时因重力会沉积在墨盒底部，易堵塞针头或细胞在打印结构中分布不均，因此亦不适合胶原蛋白生物墨水的打印。激光辅助式打印是采用激光代替喷墨式打印中的加热或压电，通过激光进行生物墨水的固化，可能会在固化过程中对生物墨水中的细胞造成较大损伤。最近，新出现的数字光处理(DLP)式打印使基于胶原蛋白的生物墨水打印得到优化。DLP式打印主要采用投影仪原理，通过将2D图像投影至液态光敏感样品池，每次固化整个层面，逐层固化成型。该方法可在低温下进行，投影采用可见光，分辨率不受喷嘴尺寸限制，较传统打印方法提高了4倍，而打印速度则较传统打印方法提高了8倍。其低温、温和和快速的特点保证了胶原蛋白三螺旋结构的稳定，但该打印方法因依靠倒置的打印平台依靠液体表面张力对生物墨水进行吸附，从而要求生物墨水粘度低、流动性高。
[0005]目前，用于DLP式3D打印的可光交联的生物墨水仍以明胶为主，主要是由于明胶提取工艺较简单；溶解度高且能在较高浓度下保持良好流动性；PH变化不会引起肽链的自组装而导致打印前交联，有利于在中性环境下与细胞混合打印；肽链结构不易受高温影响，可在打印过程中通过加热的方式保持生物墨水良好的流动性；MA改性过程中可调节PH至碱性，升温至60℃，保证取代反应在最高效率条件下进行。但基于明胶的生物墨水具有明显缺点，即机械强度低(通常报道压缩模量仅1～10kPa)，无法满足多数医学应用的需求。与明胶相比，传统胶原蛋白因其保持了完整的三螺旋结构，具有明显较高的机械强度(通常报道压缩模量数十至数百kPa)。然而，胶原蛋白制备工艺较复杂，提纯需要盐析和透析等步骤，耗时长；为保存生物活性三螺旋结构需在4℃低温下进行，但低温不利于胃蛋白酶对胶原蛋白的水解；胶原蛋白原纤维对PH变化敏感，如酸性环境下提取的胶原蛋白在中性和碱性环境中会发生自组装导致交联，溶解度降低而析出；而中性和碱性环境下提取的胶原蛋白三螺旋结构均受到不同程度的破坏；胶原蛋白浓度变化对溶液流动性影响大，无法配制高浓度墨水；在MA改性过程中，由于MA取代反应在碱性、高温条件下效率最高，反之亦然，因此胶原蛋白酸性溶液和4℃低温的反应条件不利于MA取代反应；此外，已知的胶原蛋白生物墨水由于不含光抑制剂，无法控制光交联深度，在打印多孔、中空结构时常因交联区域不可控导致过度交联，从而预留空部分也被交联而堵塞，严重影响打印精度。
[0006]综上所述，现有基于明胶的生物墨水虽然制备工艺简单，可进行DPL式3D打印，但所获得的结构机械强度低，限制了它的应用范围。目前已开发的基于胶原蛋白的生物墨水制备周期长，且仅适用于挤出式3D打印，打印精度低，可用于DLP式3D打印的生物墨水尚无报道。
[0007]在所述
技术介绍
部分公开的上述信息仅用于加强对本公开的背景的理解，因此它可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。

技术实现思路

[0008]针对现有生物墨水及其制备工艺存在的缺点和不足，本专利技术的目的之一旨在提供一种无需耗时长的盐析和透析步骤的高效、省时的可用于DLP式3D打印的I型胶原蛋白生物墨水的制备工艺，适用于实验室研究和工厂大规模生产。
[0009]本专利技术的目的之二旨在提供一种基于该墨水的DLP式3D打印技术方案，优化打印
参数，用于制作可用于细胞培养的3D打印仿生支架。
[0010]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种可3D打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0011]步骤(1)、取新鲜或冰冻牛肌腱用水洗净，切成1
×
1mm小块；将所得牛肌腱小块用75％乙醇浸泡15分钟无菌化处理；然后倒去乙醇，加入无菌水润洗三次以洗净残留乙醇。
[0012]步骤(2)、将步骤(1)中处理好的无菌牛肌腱小块加入到脱脂剂中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可3D打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)、取新鲜或冰冻牛肌腱用水洗净，切成1
×
1mm小块；将所得牛肌腱小块用75％乙醇浸泡15分钟无菌化处理；然后倒去乙醇，加入无菌水润洗三次以洗净残留乙醇。步骤(2)、将步骤(1)中处理好的无菌牛肌腱小块加入到脱脂剂中，在摇床上过夜脱脂。步骤(3)、将步骤(2)脱脂后的肌腱加入到含有胃蛋白酶的PH2.5的酸性溶液中，以搅拌速率200rpm～800rpm机械搅拌12h～72h，酶解提取消化产物。步骤(4)、将步骤(3)消化产物以3000rpm离心15min～20min；收集含有I型胶原蛋白的粘稠上清液，弃去不溶物及未消化牛肌腱颗粒。步骤(5)、I型胶原蛋白的初步纯化：将步骤(4)清液滴加NaOH调节PH值至7.0，静置15min～30min，见清液逐渐凝胶化析出；收集析出的凝胶状物，置于离心管中以3000rpm离心15min～20min；收集含有I型胶原蛋白的凝胶状沉淀，弃去上清液。步骤(6)、将步骤(5)凝胶状沉淀重新溶解于酸性溶液中，得到初步纯化后的含有I型胶原蛋白的溶液。步骤(7)、I型胶原蛋白的进一步纯化：将步骤(6)溶液置于带有分子质量截止值100kDa的滤芯的离心管中，3500rpm离心30min；分子质量低于100kDa的杂蛋白和肽链碎片被过滤至下方的废液管中，弃去；分子质量高于100kDa的I型胶原蛋白溶液则被截留于上方的收集管中；收集I型胶原蛋白溶液。步骤(8)、将步骤(7)I型胶原蛋白溶液冷冻干燥24h～48h后得到高纯度I型胶原蛋白冻干粉。步骤(9)、I型胶原蛋白的MA改性：将步骤(8)冻干粉加入酸性溶液，并以300rpm磁力搅拌过夜，配制0.5mg/mLI型胶原蛋白溶液。步骤(10)、将MA(平均摩尔质量700g/mol)按体积比1：100逐滴加入步骤(9)溶液中，在室温20℃～25℃条件下以500rpm磁力搅拌24h～48h。步骤(11)、将步骤(10)溶液置于带有分子质量截止值100kDa的滤芯的离心管中，3500rpm离心30min，过量的小分子MA及反应副产物被过滤至滤芯下方的废液管中，弃去；分子质量高于100kDa的ColMA则被截留于上方的收集管中；收集ColMA溶液。步骤(12)、将步骤(11)溶液冷冻干燥24h～48h后得到高纯度ColMA冻干粉。步骤(13)、将步骤(12)冻干粉加入酸性溶液，并以300rpm磁力搅拌过夜，配制0.5mg/mL～0.6...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈基施展，华莺，
申请(专利权)人：陈基施展，
类型：发明
国别省市：