一种用于早期肺癌无创筛查的组合物、应用与试剂盒及样本处理方法技术

本发明专利技术涉及一种用于早期肺癌无创筛查的组合物、应用与试剂盒及样本处理方法，包括：特异性检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂；和特异性检测人SHP

【技术实现步骤摘要】
一种用于早期肺癌无创筛查的组合物、应用与试剂盒及样本处理方法


[0001]本专利技术涉及肺癌早期筛查
，更具体地，本专利技术涉及一种用于早期肺癌无创筛查的组合物、应用与试剂盒及样本处理方法。

技术介绍

[0002]肺癌已经成为人类癌症死亡的主要原因之一。肺癌的发生率和死亡率是所有肿瘤中最高的，但是肺癌却不是诊断的最多的肿瘤。在当前的医疗体系下，中晚期肺癌患者五年生存率仅为10
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20％，但对于早期肺癌病人的治疗，通过手术切除的方法约有80
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90％以上可以治愈。然而绝大多数的早期肺癌患者没有明显的临床症状。患者在初次诊断出肺癌时，85％为中晚期，早期诊断的比例仅约14％，只有约16％的患者生存期能达到五年以上。因此肺癌早筛意义重大，有效的早期筛查和干预治疗可使肺癌的五年生存期提高至80％以上。
[0003]目前对于肺癌早期筛查的方法有多种，比如低剂量螺旋CT诊断、组织细胞层面的肺癌诊断、基因层面的肺癌诊断等。但这些技术手段存在诸多弊端：低剂量CT检测存在较多的假阳性；组织层面的肺癌诊断在穿刺取样方面对患者具有创伤性，且有可能导致癌细胞扩散或转移；基因层面的肿瘤特异性突变分子标志物检测技术尚未成熟，存在检测特异性和准确度问题，很多基因突变来自于健康人群中造血干细胞(Razavi，P.，et.al，Nature Medicine，2019，doi：10.1038/s41591
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019)。
[0004]DNA甲基化作为一种新型分子标志，在肿瘤诊断中的重要性日益受到重视，多个临床实验结果表明，肿瘤发生过程中某些特定基因的甲基化程度可作为肿瘤诊断的一种分子标志，并且这种改变是肿瘤所特有的。DNA甲基化发生在肿瘤的早期阶段，并且稳定存在，因而能够在肿瘤形成初期利用PCR基因检测手段提前发现，为之后的预防、治疗、疾病监控以及预后提供一个直观的潜在指标。近来国内外研究发现血浆中一些基因的甲基化DNA的含量水平用做早期诊断，敏感性要好于已有的蛋白质血清标志物，其中比较突出的有与早期肺癌相关的cyclin
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dependent kinase inhibitor 2A gene p16(p16)，SHOX
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2，RASSF1A，CDH1等基因。但是目前上市的肺癌甲基化检测试剂盒(SHOX
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2，RASSF1A)由于检测灵敏度不足仅局限于肿瘤组织水平以及肺泡灌洗液样本。而通过患者血浆进行高灵敏和特异性肺癌早期检测与预后评估的标志物还很缺乏。

技术实现思路

[0005]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种用于早期肺癌无创筛查的组合物、应用与试剂盒及样本处理方法，能够提高检测的准确性及特异性，在分子水平上对于肺癌早期筛查具有很强针对性，具有检测特异性好、灵敏度高和可靠性佳等优点，这样对于早期可能的肺癌患者及早的进行预防以及采取相应的治疗措施。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]本专利技术提供一种用于早期肺癌无创筛查的组合物，所述的组合物中包括：特异性
检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂；和特异性检测人SHP
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1基因的DNA甲基化的检测试剂。
[0008]在一个优选例，所述的特异性检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂是针对人CDH1基因的引物和探针；较佳地，所述的引物和探针针对人CDH1基因中经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列；
[0009]所述的特异性检测人SHP
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1基因的DNA甲基化的检测试剂是针对人SHP
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1基因的引物和探针；较佳地，所述的引物和探针针对人CDH1基因经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列。
[0010]所述的特异性检测CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂是：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物以及SEQ ID NO：3所示的探针；所述的特异性检测人SHP
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1基因的DNA甲基化的检测试剂是：SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的引物以及SEQ ID NO：6所示的探针。
[0011]所述的用于早期肺癌无创筛查的组合物，其特征在于，所述组合物还包括CDH1基因2个非甲基化基因位点对应的探针，序列为SEQ ID NO:7；SHP
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1基因2个非甲基化基因位点对应的探针，序列为SEQ ID NO:8。
[0012]本专利技术还提供了一种用于肺癌无创筛查的甲基化检测试剂盒，包括上述的组合物。
[0013]在一个优选例中，所述的特异性检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂是针对人CDH1基因的引物和探针；较佳地，所述的引物和探针针对人CDH1基因经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列；更佳地，所述的特异性检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂是：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2示的引物以及SEQ ID NO：3所示的探针；
[0014]所述的特异性检测SHP
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1基因的DNA甲基化的检测试剂是针对人SHP
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1基因的引物和探针；较佳地，所述的引物和探针针对人SHP
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1基因经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列；更佳地，所述的特异性检测人SHP
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1基因的DNA甲基化的检测试剂是：SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的引物以及SEQ ID NO：6所示的探针。
[0015]在另一优选例中，试剂盒中，所述的试剂盒中还包括：特异性检测内参基因的检测试剂；较佳地，所述的特异性检测内参基因的检测试剂是针对人β
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actin基因的引物和探针；更佳地，所述的引物和探针针对人β
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actin基因经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列；更佳地，所述的特异性检测内参基因的DNA甲基化的检测试剂是：SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的引物以及SEQ ID NO：11所示的探针。
[0016]在另一优选例中，试剂盒中，针对每一基因的探针连接有特定的荧光基团；较佳地，针对人CDH1基因的探针标记FAM荧光素，针对人SHP
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1基因的探针标记HEX荧光素，针对人β
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actin基因的探针标记ROX或VIC荧光素。
[0017]在另一优选例中，该试剂盒中，还包括(但不限于)：DNA聚合酶(如Taq酶)、dNTPs、Mg
2+
离子或包含DNA聚合酶(如Taq酶)、dNTPs、Mg
2+
离子的PCR体系；较佳地，所述的包含DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+离子的PCR体系中，较佳地，所述的Mg
2+
离子浓度为3.0
±
0.5mM；或所述的dNTPs浓度为0.2
±
0.3mM；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于早期肺癌无创筛查的组合物，其特征在于，所述的组合物包括：特异性检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂；和特异性检测人SHP
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1基因的DNA甲基化的检测试剂。2.根据权利要求1所述的用于早期肺癌无创筛查的组合物，其特征在于，所述的特异性检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂是针对人CDH1基因的引物和探针；所述的特异性检测人SHP
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1基因的DNA甲基化的检测试剂是针对人SHP
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1基因的引物和探针。3.根据权利要求2所述的用于早期肺癌无创筛查的组合物，其特征在于，所述的特异性检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂是:SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物以及SEQ ID NO:3所示的探针；所述的特异性检测人SHP
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1基因的DNA甲基化的检测试剂是:SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物以及SEQ ID NO:6所示的探针。4.根据权利要求1所述的用于早期肺癌无创筛查的组合物，其特征在于，所述组合物还包括CDH1基因2个非甲基化基因位点对应的探针，序列为SEQ ID NO:7；SHP
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1基因2个非甲基化基因位点对应的探针，序列为SEQ ID NO:8。5.一种如权利要求1
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4任一项所述的用于肺癌无创筛查的组合物在制备用于肺癌早期无创筛查、疗效检测、预后评估的试剂盒中的应用。6.一种用于肺癌无创筛查的甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1
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4所述的用于肺癌无创筛查的组合物。7.根据权利要求6所述的一种用于肺癌无创筛查的甲基化...

【专利技术属性】
技术研发人员：亓立峰，
申请(专利权)人：上海纳奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：