用于检测腺相关病毒的方法和试剂盒技术

本公开提供了用于检测腺相关病毒的方法和试剂盒。在一些实施例中，所述腺相关病毒是Anc80。检测方法包含基于HPLC和ELISA的方法。检测方法包含基于HPLC和ELISA的方法。检测方法包含基于HPLC和ELISA的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测腺相关病毒的方法和试剂盒


[0001]本公开提供了用于检测腺相关病毒的方法和试剂盒。在一些实施例中，所述腺相关病毒是Anc80。检测方法包含基于HPLC和ELISA的方法。

技术介绍

[0002]腺相关病毒(AAV)已经成为基因疗法的重要工具。通常，用于基因疗法的AAV是经组装病毒颗粒，所述病毒颗粒例如缺乏天然病毒基因并且仅含有所关注序列，如所关注基因(GOI)，从而产生重组AAV(rAAV)。然后，所关注基因通过rAAV颗粒递送到宿主细胞中。用于产生rAAV颗粒的典型过程涉及将至少两种质粒递送到生产细胞中：第一质粒，所述第一质粒含有所关注基因，所述所关注基因侧接反向末端重复(ITR)序列，所述序列发现于天然AAV基因组中(ITR/GOI质粒)；第二质粒，所述第二质粒含有要反式表达以进行病毒组装的AAV rep/cap基因(rep/cap质粒)；以及第三质粒，所述第三质粒通常含有来自腺病毒或疱疹病毒的辅助基因(辅助质粒)。然后，生产细胞产生含有ITR/GOI质粒的经组装rAAV颗粒(即，“经包装”rAAV)，并且然后可以从生产细胞中分离和纯化经包装rAAV。
[0003]rAAV的纯化通常涉及：收获生产细胞；裂解生产细胞；使细胞裂解物经历梯度纯化(例如，使用碘克沙醇梯度)和/或快速蛋白液相色谱(FPLC)，其可以是基于离子交换、尺寸排阻和/或亲和力的；以及缓冲液交换和浓缩，例如，使用切向流过滤。在纯化之后，通常测量rAAV滴度。例如在Naso等人，《生物制药(BioDrugs)》31(4):317r/>‑
334(2017)和WO 2018/150269中进一步描述了重组AAV以及生产和纯化的方法。
[0004]从生产细胞中纯化AAV，例如rAAV可能是一个耗时且劳动密集的过程。由于病毒滴定通常直到获得经基本上纯化的样品之后才进行，例如在大多数或所有纯化步骤之后，低产率批次(例如，低病毒颗粒数量和/或低全/空衣壳比率)直到花费大量时间和试剂之后才被检测到，这大大增加了成本并且降低了生产效率。
[0005]与AAV产生相关的另一个挑战是大规模开发针对不同病毒载体的优化过程。上游和下游过程两者的迭代优化利用分析工具来表征和定量过程中样品的病毒产物。

技术实现思路

[0006]在一些实施例中，本公开提供了一种用于检测样品中的腺相关病毒血清型Anc80的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与以下接触：(i)捕获试剂，所述捕获试剂与腺相关病毒(AAVx)或腺相关病毒血清型8(AAV8)结合；以及(ii)检测试剂，所述检测试剂与腺相关病毒(AAVx)结合；(b)形成包括所述捕获试剂、所述Anc80和所述检测试剂的结合复合物；以及(c)检测所述结合复合物，由此检测所述样品中的所述Anc80。
[0007]在另外的实施例中，本公开提供了一种试剂盒，其包括：(a)捕获试剂，所述捕获试剂与腺相关病毒(AAVx)结合；以及(b)检测试剂，所述检测试剂与腺相关病毒(AAVx)结合。
[0008]在另外的实施例中，本公开提供了一种测定细胞悬浮液或细胞裂解物中的腺相关病毒的衣壳滴度的方法，所述方法包括：(a)使所述细胞悬浮液或细胞裂解物经历高效液相
和“包含(include)”)或“含有(containing)”(及其任何变体或形式，如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包容性的或开放性的并且不排除另外的未列举的元素或方法步骤。设想的是，本说明书中讨论的任何实施例可以关于本公开的任何方法和/或试剂盒实施。
[0022]术语“例如(for example)”及其对应的缩写“例如(e.g.)”的使用意指所引用的特定术语是本公开的代表性实例和实施例，除非另有明确说明，否则所述代表性实例和实施例不旨在限于所参考或引用的特定实例。
[0023]如本文所使用的，“在
…
之间”是包含范围末端的范围。例如，x与y之间的数字明确地包含数字x和y以及落入x和y内的任何数字。
[0024]如本文提及的，“腺相关病毒”或“AAV”是指含有细小病毒科(Parvoviridae)和依赖细小病毒属(Dependoparvovirus)的单链DNA的小型、复制缺陷型、无包膜病毒或病毒颗粒。腺相关病毒还包含祖先AAV(Anc AAV)。AAV血清型的非限制性实例包含Anc80、Anc80L27、Anc80L65、Anc80L121、AAV1、AAV
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2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV1.1、AAV2.5、AAV2i8、AAV2G9、AAV2tYF、AAV2
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TT、AAV2
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TT
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S312N、AAV3B、AAV3B
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S312N、AAV
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LK3、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV.7m8、AAV9.45、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV.HSC16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh32、AAV.rh33、AAV.rh39、AAV.rh74、AAV.RHM4
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1、AAV.RHM15
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1、AAV.RHM15
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2、AAV.RHM15
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3、AAV.RHM15
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4、AAV.RHM15
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5、AAV.RHM15
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6、AAV.cy10、AAV.dj、AAV.po4、AAV.po6、AAV.hu26、AAV.hu37、AAV.PHP.B、Anc126和Anc127。除了这些血清型之外，还开发了AAV假型。AAV假型含有第一血清型的衣壳和第二血清型的基因组(例如，假型AAV2/5对应于具有血清型AAV2的基因组和AAV5的衣壳的AAV)。在以下文献中描述了产生AAV的衍生物、修饰和/或假型的方法：例如Asokan等人，《分子疗法(Mol.Ther)》20(4):699
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708(2012)。
[0025]如本文所使用的，“rep”基因是指AAV基因组的本领域公认的编码AAV的复制蛋白的区，所述复制蛋白是复制病毒基因组共同地需要的。rep还指AAV基因的功能性同源物，如人疱疹病毒6(HHV
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6)rep基因，其也已知介导AAV DNA复制。在一些实施例中，本文所述的AAV编码rep编码区。
[0026]如本文所使用的，“cap”基因是指本领域公认的编码AAV的衣壳蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于检测样品中的腺相关病毒血清型Anc80的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与以下接触：(i)捕获试剂，所述捕获试剂与腺相关病毒(AAVx)或腺相关病毒血清型8(AAV8)结合；以及(ii)检测试剂，所述检测试剂与腺相关病毒(AAVx)结合；(b)形成包括所述捕获试剂、所述Anc80和所述检测试剂的结合复合物；以及(c)检测所述结合复合物，由此检测所述样品中的所述Anc80。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述捕获试剂和/或所述检测试剂是抗体或其抗原结合片段。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述捕获试剂固定在表面上。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述捕获试剂包括生物素，并且所述表面包括亲和素或链霉亲和素。5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述表面是多孔板，并且所述捕获试剂固定在所述多孔板的孔中。6.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中所述捕获试剂与AAVx结合。7.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中所述捕获试剂与AAV8结合。8.根据权利要求1到7中任一项所述的方法，其中所述捕获试剂与所述Anc80的病毒颗粒结合。9.根据权利要求7所述的方法，其中所述捕获试剂与VP3结合。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述捕获试剂与VP3的残基580到600内的表位结合。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述捕获试剂与LQSANT(SEQ ID NO:1)结合。12.根据权利要求1到11中任一项所述的方法，其中所述检测试剂与AAVx结合。13.根据权利要求1到11中任一项所述的方法，其中所述检测试剂与AAV8结合。14.根据权利要求1到13中任一项所述的方法，其中所述检测试剂与所述Anc80的病毒颗粒结合。15.根据权利要求1到14中任一项所述的方法，其中所述检测试剂包括可检测部分的结合配偶体。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述检测试剂包括生物素，并且所述可检测部分包括与亲和素或链霉亲和素缀合的辣根过氧化物酶。17.根据权利要求1所述的方法，其中所述捕获试剂与AAV8结合，并且所述检测试剂与AAVx结合。18.一种试剂盒，其包括：(a)捕获试剂，所述捕获试剂与腺相关病毒(AAVx)或腺相关病毒血清型8(AAV8)结合；以及(b)检测试剂，所述检测试剂与腺相关病毒(AAVx)结合。19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述捕获试剂和/或所述检测试剂是抗体或其抗原结合片段。20.根据权利要求18或19所述的试剂盒，其进一步包括捕获表面。21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述捕获试剂包括生物素，并且所述捕获表面包括与其连接的亲和素或链霉亲和素。
22.根据权利要求20或21所述的试剂盒，其中所述捕获表面是多孔板，并且所述捕获试剂固定在所述多孔板的孔上。23.根据权利要求18到22中任一项所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王鹏，顾炳南，A，
申请(专利权)人：隆萨休斯敦股份有限公司，
类型：发明
国别省市：