一种改善子宫内膜厚度的复合制剂制造技术

本发明专利技术公开了一种改善子宫内膜厚度的复合制剂，属于生物医药技术领域。所述复合制剂由以下组分组成：子宫内膜干细胞悬液，1～3ml；脱细胞子宫内膜，2～4ml；PRP，0.5～1.2ml；TGF

【技术实现步骤摘要】
一种改善子宫内膜厚度的复合制剂


[0001]本专利技术涉及一种改善子宫内膜厚度的复合制剂，属于生物医药


技术介绍

[0002]辅助生殖技术的成功受胚胎质量、子宫内膜容受性及胚胎与内膜之间的同步三大因素的影响。多次宫腔操作史、宫腔炎症、子宫内膜结核等导致的薄型子宫内膜会对妊娠结局造成严重影响。
[0003]成功妊娠的关键因素为子宫内膜厚度适宜，临床上当子宫内膜厚度小于7mm时被称为薄型子宫内膜。薄型子宫内膜以子宫动脉血流高阻力、腺上皮生长受限、血管内皮生长因子低表达和血管发育不良为主要病理特征，从而影响子宫内膜容受性。
[0004]目前临床上的药物治疗包括大剂量雌激素、低剂量阿司匹林、西地那非。近年来，也有宫腔灌注人绒毛膜促性腺激素、粒细胞集落刺激因子、富血小板血浆的报道，但是疗效不确定。
[0005]富血小板血浆(Platelet
‑
rich plasma，PRP)为自体周围静脉血经细胞分离提取得到的浓缩血小板血浆。PRP富含血小板源生长因子，血管内皮生长因子、转化生长因子、表皮生长因子、胰岛素生长因子、成纤维细胞生长因子等，可调节细胞间的迁移、扩散、分化，促进细胞外基质的积累。另外活化的PRP促进了人类子宫内膜干/祖细胞的迁移，如经血间充质干细胞、子宫内膜间充质干细胞和骨髓间充质干细胞等。促进间充质细胞和上皮细胞之间的转化。PRP在眼科、整形外科、骨科等领域应用广泛，其能刺激脂肪、皮肤和黏膜等软组织以及肌腱、骨骼等组织的再生。
[0006]越来越多的临床和基础实验研究表明干细胞对子宫内膜修复的可行性。干细胞在子宫内膜修复方面的作用可能是由于其强大的分化能力，也可能是由于其分泌的生物活性分子对组织的修复再生、抗炎及免疫调节方面发挥重要作用，更多的猜测可能是干细胞多种功能共同起作用的结果。近年来临床上应用干细胞修复受损子宫内膜进行了多次尝试。2011年Nagori等在宫腔粘连分解术后，将自体骨髓间充质干细胞灌注到病人子宫腔内，并加以雌激素治疗，经过4个雌激素人工周期治疗后，行体外受精
‑
胚胎移植术成功妊娠。2013年，Zhao等针对反复流产导致的难治型病人，常规治疗无效后，行宫腔粘连分解术，术后利用骨髓间充质干细胞联合雌激素人工周期治疗，使其成功受孕。2014年，Singh等对宫腔镜诊断为重度宫腔粘连的病人进行了自体骨髓间充质干细胞治疗，病人治疗前均有继发性闭经或不孕病史，且行传统宫腔粘连分解术及雌激素治疗失败，骨髓间充质干细胞治疗3、6、9个月后，所有病人内膜厚度较治疗前均有明显增加，其中5例病人恢复了月经。南京戴建武团队研制出胶原支架复合自身干细胞的方法，通过将干细胞附着在胶原支架上，然后将其放到病人宫腔中，结合传统的宫腔镜的改进，实现对受损子宫内膜的功能性修复，有病人相继怀孕并顺利生产。
[0007]理想的细胞移植方法应满足以下四个条件：细胞应聚集在受伤区域局部，相对浓度较高；细胞应均匀分布在子宫内膜内；细胞应有效粘附在子宫内膜上，而不是挤出子宫
腔；不应有生物毒性和免疫原性。为了满足这些要求，细胞应该播种在支架材料上，通过构筑组织工程的三要素(细胞，支架材料和生长因子)来进行移植。
[0008]目前使用子宫内膜细胞在治疗中容易从宫腔内流出，此外单纯使用干细胞无法达到满意的效果，即使使用如透明质酸钠、自体PRP增加产品的粘稠性，增加细胞的停留时间，但是有效性也不确定。
[0009]中国专利技术专利申请CN 112451544 A公开了用于改善薄型子宫内膜的组合物及其制备方法、应用，其中用于改善薄型子宫内膜的组合物由干细胞培养上清与维生素E组成，在使用后可增强子宫内膜中VEGF和整合素β3的表达，增加子宫内膜的厚度，改善子宫容受性和血液供给。但是该组合物只有组织工程三要素中的生长因子，并没有细胞成份，也无支架材料，难以获得满意的治疗效果。

技术实现思路

[0010]针对上述现有技术，本专利技术提供了一种改善子宫内膜厚度的复合制剂。
[0011]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0012]一种改善子宫内膜厚度的复合制剂，由以下组分组成：子宫内膜干细胞悬液，1～3ml；脱细胞子宫内膜，2～4g；PRP，0.5～1.2ml；TGF
‑
β中和抗体，终浓度为0.5～3ng/ml；CXCL5，终浓度为0.5～3ng/ml。
[0013]所述子宫内膜干细胞悬液是通过以下方法制备得到的：洗去子宫内膜组织表面残留血液；剪碎，置于胶原酶溶液中消化；离心收集组织块及细胞，过细胞滤网收集细胞；将细胞接种于间充质干细胞培养基中，置入培养箱内，37℃、5％CO2、饱和湿度培养，每3天换液一次；待原代收集后每3～4天使用胰蛋白酶消化传代培养，所得培养液即为子宫内膜干细胞悬液，调整细胞密度至0.5
×
107～3
×
107个/ml。
[0014]所述脱细胞子宫内膜是通过以下方法制备得到的：
[0015](1)洗去子宫内膜组织表面残留血液；剪碎得子宫内膜碎片；
[0016](2)子宫内膜碎片在
‑
80℃和37℃下分别进行三次冷冻/解冻循环；
[0017](3)子宫内膜碎片在室温、1％的Triton X
‑
100溶液、50rpm条件下孵化15小时；
[0018](4)将子宫内膜碎片取出，置于浓度1％的SDS溶液中72小时；
[0019](5)将子宫内膜碎片取出，冲洗，即得脱细胞子宫内膜。
[0020]优选的，由以下组分组成：子宫内膜干细胞悬液，2ml；脱细胞子宫内膜，3ml；PRP，1.0ml；TGF
‑
β中和抗体，终浓度为1ng/ml；CXCL5，终浓度为1ng/ml。
[0021]进一步地，所述PRP，最好是自体PRP，以避免排异反应、过敏反应等。
[0022]所述改善子宫内膜厚度的复合制剂在制备具有修复子宫内膜功效的制剂中的应用。
[0023]现有技术中使用的支架材料主要是凝胶或胶原材料，其生物特性无法与真正的子宫内膜相比，而脱细胞的子宫内膜含有丰富的细胞外基质，可以模拟子宫内膜的微环境，如三维结构及其细胞与细胞外基质的相互作用。本专利技术的脱细胞子宫内膜，可以支持人子宫内膜干细胞的体外培养，可以提高子宫内膜干细胞的增殖率。本专利技术选取了子宫内膜的功能层内膜，而不是整个子宫内膜，因为基底层与功能层不同，其含有的细胞外基质也不同。
[0024]本专利技术的改善子宫内膜厚度的复合制剂，含有子宫内膜干细胞，可以修复子宫内
膜。含有PRP，提供生长因子。含有子宫内膜凝胶，作为子宫内膜干细胞的支架。含有TGF
‑
β1中和抗体，TGF
‑
β1中和抗体是与伤口愈合密切相关的细胞因子，也是组织纤维化和瘢痕病理过程中的关键性细胞因子，添加TGF
‑
β1中和抗体可避免子宫内膜瘢痕的形成。含有CXCL5，CXCL5作为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种改善子宫内膜厚度的复合制剂，其特征在于，由以下组分组成：子宫内膜干细胞悬液，1～3ml；脱细胞子宫内膜，2～4g；PRP，0.5～1.2ml；TGF
‑
β中和抗体，终浓度为0.5～3ng/ml；CXCL5，终浓度为0.5～3ng/ml。2.根据权利要求1所述的改善子宫内膜厚度的复合制剂，其特征在于，所述子宫内膜干细胞悬液是通过以下方法制备得到的：洗去子宫内膜组织表面残留血液；剪碎，置于胶原酶溶液中消化；离心收集组织块及细胞，过细胞滤网收集细胞；将细胞接种于间充质干细胞培养基中，置入培养箱内，37℃、5％CO2、饱和湿度培养，每3天换液一次；待原代收集后每3～4天使用胰蛋白酶消化传代培养，所得培养液即为子宫内膜干细胞悬液，调整细胞密度至0.5
×
107～3
×
107个/ml。3.根据权利要求1或2所述的改善子宫内膜厚度的复合制剂，其特征在于：所述子宫内膜干细胞悬液的细胞密度为1
×

【专利技术属性】
技术研发人员：任海琴，周娜，刘玲，许娇，王欢，
申请(专利权)人：沈阳菁华医院有限公司，
类型：发明
国别省市：