基于红外光谱技术的蛋白质纯度计量基准方法技术

本发明专利技术的基于红外光谱技术的蛋白质纯度计量基准方法包括：初步测定样品中多肽或蛋白质含量、制备校准溶液和同位素标记溶液、对样品进行衍生化、对校准溶液进行衍生化和将上述衍生化后的样品和衍生化后的校准溶液分别进行气相色谱

【技术实现步骤摘要】
基于红外光谱技术的蛋白质纯度计量基准方法


[0001]本专利技术涉及生物化学检测领域，特别是涉及一种基于红外光谱技术的蛋白质纯度计量基准方法。

技术介绍

[0002]计量是实现单位统一、量值准确可靠的活动，研究建立高准确度的测量方法是计量学研究的重要内容之一。基准测量方法是一种具有最高计量学品质的测量方法，其操作可以被完全地描述和理解，最终不确定度可以用SI单位表述，测量结果不依赖被测量的测量校准。基准方法是形成量值源头的依据。
[0003]随着生物技术的发展，生命科学已经经历了从“描述生物学”向“实验生物学”再向“创造生物学”发展的过程，当今的生命科学已经成为了精准分析和定量的科学。人们借助信息技术和工程学的帮助，依靠对生命体的各类生命现象的准确分析、精确定量，得以实现对生命体全方位的调控与干预。
[0004]通过建立量值溯源传递体系来保证检测结果的准确一致已经成为共识，是计量界的通行做法并在传统的物理计量与化学计量领域得到广泛和成功的应用。例如，美国国家计量院NIST通过胆固醇计划的实施建立了国内的胆固醇的量值溯源传递体系，使得临床胆固醇检测假阳性率从1949年的23.7％下降到2000年的3％，不仅每年可以节约近1亿美元的检测费用，而且极大程度的保护了国民健康。
[0005]量值溯源传递体系的建立一是要有量值的源头，二是要有量值传递方法，尤其是要有具有较高测量准确度的“基准”方法，才能保证国家基准复现的量值能够准确的传递到下一级的校准物质或工作计量器具上。因此，高准确度的计量方法研究在计量及量值溯源传递中具有举足轻重的作用。
[0006]1995年国际计量局物质的量咨询委员会(CCQM)首次会议上，国际计量局原局长T.J.Quinn对“基准方法”进行了定义：基准方法(Primary Method)是具有最高计量品质(也即最高的准确度)的方法，成为基准方法具有两个特征，第一是操作可以被完全地描述和理解，第二是不确定度可直接用SI单位(International System of Units)表述。因此，CCQM认定只有重量法、同位素稀释质谱法、库仑法、凝固点下降法和滴定法5种方法是基准方法。CCQM在1998年根据基准方法的定义，将基准方法进一步分为直接基准法和比例基准法。
[0007]直接基准法是指在测量未知物含量时不需要相同的校准作为参考，所得到的测量结果能够直接溯源至SI单位(如重量法和库仑法)。
[0008]比例基准法则是通过测量未知物与已知量的比例进行定量，需要以相同量的测量结果作为参考校准，其操作必须通过测量等式完全描述(如同位素稀释质谱法)。参考量的测量结果可以直接溯源至SI单位，与比例基准法结合后便可以保证测量结果能够直接溯源到SI单位。同时，如果一个方法的操作不能通过测量等式完全描述，则不能作为比例基准方法。
[0009]在基准方法的定义中“最高计量品质”要求基准方法的测量结果应具有足够小的
测量不确定度，同时测量结果能够溯源至SI单位。而“不确定度表述”则要求方法的操作测量等式可以以SI单位进行表达，从而保证不确定度溯源的完整性。Quinn博士提出“用基准方法的定义测定物质的量是非常复杂的”。因此CCQM认为基准方法需要至少满足下述两个条件：首先，基准方法对定义的物质必须是特定的；其次，所有参数、依赖其他物质或基体的修正数值，必须是已知的或能以适当的不确定度进行计算。
[0010]多肽或蛋白质纯度是蛋白质的基本属性，它描述了被定义的“蛋白质分子”数量的多少，是蛋白质测量的基本量值，位于量值溯源传递链的顶端。因此，要保证蛋白质含量检测结果的准确可比，必须研究建立高准确度的蛋白质含量计量方法，才能实现蛋白质量值的准确传递，从而达到检测结果准确可比、实现检测结果的互通与互认、保证贸易公平、保护人民大众健康的目的。多肽或蛋白质纯度最常用的计量基准方法是同位素稀释质谱法，该方法同样采用同位素标记化合物作为内标，通过在样品和校准中添加同位素标记物后采用单点法、括号法或校准曲线法对样品中的目标物含量进行测定。但是由于质谱采用的是离子光学系统，其稳定性不如光学系统，而且由于离子的空间电场效应，其动态范围受限制。且方法单一，很难通过不同的方法进行相互的验证。因此，建立一种基于光谱技术的准确度更高、重复性更好的计量基准方法是尤为必要和迫切的。

技术实现思路

[0011]本申请的专利技术目的是基于红外光谱技术的蛋白质纯度计量基准方法，该方法采用待测目标物的同位素标记物作为内标，与传统计量学基准方法——同位素稀释质谱法非常类似，其不同在于：不是采用离子流出色谱图上的峰面积或峰高比为依据进行定量，而是取色谱峰某一位置如峰顶处的红外光谱上的峰高或峰面积比为依据进行定量，而且对于同一个色谱峰可以从峰的不同位置提取出多组红外光谱图计算峰高或峰面积比，结果更为准确。同时，不同于同位素稀释质谱法要求同位素内标物必须比非标记目标物质量数至少大3的要求，本方法可以采用质量数仅大1的同位素内标物进行分析，大大降低了分析成本。采用校准曲线法计算样品中目标化合物的含量，符合计量基准方法的定义，是一种比例基准法。
[0012]为了完成本申请的专利技术目的，本申请采用以下技术方案：
[0013]本专利技术的一种基于红外光谱技术的蛋白质纯度计量基准方法，其中：包括如下步骤：
[0014](一)、初步测定样品中多肽或蛋白质含量
[0015]用常规的方法，初步测定出样品中多肽或蛋白质的浓度，根据该初测浓度，计算出其完全水解后的一种或几种稳定氨基酸的浓度；
[0016](二)、制备校准溶液和同位素标记溶液
[0017]用0.1mol/L的盐酸溶液分别配制出与样品水解后稳定氨基酸浓度接近的其中一种或几种稳定氨基酸的校准溶液，以及对应的同位素标记氨基酸的标记溶液，得到校准溶液和同位素标记溶液；
[0018](三)、对样品进行衍生化
[0019](a)、在样品中加入同位素标记溶液并水解
[0020]取上述步骤(一)的一定量样品，在样品中加入与其同体积的步骤(二)中同位素标
记溶液，准确地称量样品的质量和同位素标记溶液的质量；充分混合后采用离心浓缩或氮气进行吹干，在吹干的容器中，按照每100μg多肽或蛋白质中加入(100～1000)μL的(6～8)mol/L的盐酸溶液，用氮气吹扫2min后密封水解容器，放置到烘箱中于(110～130)℃水解(24～96)h，水解后的溶液再次采用离心浓缩或氮气进行吹干，得到干态样品混合物；
[0021](b)、采用衍生化试剂对步骤(a)的干态样品混合物进行衍生
[0022]用甲氧基胺盐酸盐和N,O
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双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)作为衍生化试剂，甲氧基胺盐酸盐和N,O
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双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)的体积比为1:19，按照每100μg多肽或蛋白质中加入(50～200)μL衍生化试剂的比例，在上述步骤(a)干态样品混合物中加入上述衍生化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于红外光谱技术的蛋白质纯度计量基准方法，其特征在于：包括如下步骤：(一)、初步测定样品中多肽或蛋白质含量用常规的方法，初步测定出样品中多肽或蛋白质的浓度，根据该初测浓度，计算出其完全水解后的一种或几种稳定氨基酸的浓度；(二)、制备校准溶液和同位素标记溶液用0.1mol/L的盐酸溶液分别配制出与样品水解后稳定氨基酸浓度接近的其中一种或几种稳定氨基酸的校准溶液，以及对应的同位素标记氨基酸的标记溶液，得到校准溶液和同位素标记溶液；(三)、对样品进行衍生化(a)、在样品中加入同位素标记溶液并水解取上述步骤(一)的一定量样品，在样品中加入与其同体积的步骤(二)中同位素标记溶液，准确地称量样品的质量和同位素标记溶液的质量；充分混合后采用离心浓缩或氮气进行吹干，在吹干的容器中，按照每100μg多肽或蛋白质中加入(100～1000)μL的(6～8)mol/L的盐酸溶液，用氮气吹扫2min后密封水解容器，放置到烘箱中于(110～130)℃水解(24～96)h，水解后的溶液再次采用离心浓缩或氮气进行吹干，得到干态样品混合物；(b)、采用衍生化试剂对步骤(a)的干态样品混合物进行衍生用甲氧基胺盐酸盐和N,O
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双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)作为衍生化试剂，甲氧基胺盐酸盐和N,O
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双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)的体积比为1:19，按照每100μg多肽或蛋白质中加入(50～200)μL衍生化试剂的比例，在上述步骤(a)干态样品混合物中加入上述衍生化试剂，用氮气吹扫1min，然后放入密封容器，在(40～90)℃的加热台上衍生化(0.5～2)h后，得到衍生化后的样品；(四)、对校准溶液进行衍生化(c)、在校准溶液中加入同位素标记溶液并水解取上述步骤(二)的一定量校准溶液，在上述校准溶液中加入与其体积之比为0.8
‑
1.2的步骤(二)中同位素标记溶液，分别准确地称量对应的校准溶液质量和同位素标记溶液质量，按照上述方式配制出至少五个浓度水平的校准混合溶液；充分混合后采用离心浓缩或氮气吹干，在吹干的容器中，按照每100μg多肽或蛋白质中加入(100～1000)μL的(6～8)mol/L的盐酸，再次采用离心浓缩或氮气进行吹干，得到至少五种干态校准混合物；(d)、采用衍生化试剂对步骤(c)中干态校准混合物进行衍生用甲氧基胺盐酸盐和N,O
‑
双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)作为衍生化试剂，甲氧基胺盐酸盐和N,O
‑
双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)的体积比为1:19，按照每100μg多肽或蛋白质加入(50～200)μL衍生化试剂的比例，在上述步骤(c)至少五个浓度水平的干态校准混合物中分别加入上述衍生化试剂，用氮气吹扫1min，然后放入密封容器，在(40～90)℃的加热台上衍生化(0.5～2)h，得到至少五个浓度水平的衍生化后的校准溶液；(五)、将上述衍生化后的样品和衍生化后的校准溶液分别进行气相色谱
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红外光谱分析(e)、用气相色谱
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红外光谱仪对衍生化后的样品和衍生化后的校准溶液进行检测将上述衍生化后的样品和衍生化后的校准溶液分别装入气相色谱
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红外光谱仪的气相色谱样品瓶中，进行气相色谱
‑
红外光谱分析，进样量为(1～2)μL，在红外谱图(1000～
2000)cm
‑1的范围内进行采集，记录流出的色谱图，并在色谱图上找到某一种氨基酸的色谱峰，提取色谱峰峰顶区域的红外光谱图,分别记录红外光谱图上衍生化后的样品和衍生化后的校准溶液中的同一种非标记氨基酸及同位素标记氨基酸相应峰的峰高或峰面积；(f)、用衍生化后的校准溶液拟合形成校准曲线将衍生化后的校准溶液中各个浓度水平的某一种非标记氨基酸及同位素标记氨基酸的峰高或峰面积相比，得到不同浓度水平衍生化后的校准溶液的峰高比或者峰面积比，再将衍生化后的校准溶液中加入的非标记氨基酸和对应同位素标记氨基酸的质量比与上述相应的峰高或峰面积比进行拟合形成校准曲线；(g)、计算出样品水解液中氨基酸的浓度c
AA
将步骤(e)衍生化后的样品中的同一种非标记氨基酸和同位素标记氨基酸的峰高或峰面积相比代入到校准曲线中，得到衍生化后的样品水解液中的同一种非标记氨基酸和同位素标记氨基酸的质量比m
r
，根据样品中加入的同位素标记溶液的质量m
L
‑
AA
和样品的质量m，按照以下公式(6)，计算出样品水解液中同一种氨基酸的浓度c
AA
，c
AA
＝m
γ
m
L
‑
AA
/m
ꢀꢀ
公式(6)；按照以下公式(7)，计算出多肽或蛋白质的浓度c，公式(7)中，c
AA
为水解液中一种氨基酸的浓度，MW为蛋白质的分子量，MW
AA
为对应的氨基酸分子量，N
AA
为一个蛋白质分子中含有的上述对应氨基酸残基的个数；当采用几种氨基酸测定多肽或蛋白质浓度时，得到样品水解液中几种氨基酸的浓度c
AA1
、c
AA2
………
，和以及据此计算的几种多肽或蛋白质的浓度c1、c2………
，多肽或蛋白质的最终纯度为上述几种多肽或蛋白质的浓度的算数平均值。2.根据权利要求1所述的基于红外光谱技术的蛋白质纯度计量基准方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：武利庆，周冬梅，张宁，刘亚辉，翟睿，杨彬，
申请(专利权)人：中国计量科学研究院，
类型：发明
国别省市：