miR-34b/c基因抑制剂在调控施氏鲟早期性别分化中的应用制造技术

本发明专利技术公开了miR

【技术实现步骤摘要】
miR
‑
34b/c基因抑制剂在调控施氏鲟早期性别分化中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及miR
‑
34b/c基因抑制剂在调控施氏鲟早期性别分化中的应用。

技术介绍

[0002]鲟鱼是一种古老的鱼类，与恐龙同时代，在地球上生存了2亿年，具有很高的经济价值和科研价值。鲟鱼鱼肉营养出众、浑身是宝、是鱼中的“善存”；鲟鱼最主要的经济附加值体现在由鲟鱼子制成的鱼子酱上，富含人体必需氨基酸、多种不饱和脂肪酸、维生素等物质，营养价值极高，享有“黑色黄金”的美誉。
[0003]施氏鲟(Acipenser schrenckii)是我国黑龙江水系特有珍稀名贵的大型经济鱼类。施氏鲟的人工繁育早在19世纪30年代开始，因其具有生长速度快、抗病力及适应性强等优点，上个世纪90年代以来已成为养殖鲟鱼中的杂交亲本和鱼子酱生产的鲟鱼养殖产业中的重要养殖品种之一。
[0004]在施氏鲟养殖上如果能够在性别分化早期进行性别筛选，将生长速度更快的雄性鱼做商品鱼提前上市，而挑选优秀的雌性施氏鲟留作鱼子酱生产，则可以获得更高的经济效益。因此，鲟鱼性别分化方向调控的繁育新技术成为目前鲟鱼养殖产业可持续化发展的重点关注领域。施氏鲟在孵化后5月龄性腺发育进入活跃期，6月龄处在性别分化的敏感期，之后在7 月龄开始出现最初的雌雄性不同的生殖上皮特征，雌性呈皱褶型，雄性呈光滑型生殖上皮，据统计，8月龄时鲟鱼群体会有75.86％的个体出现性别分化的最初特征。从鲟鱼性别分化敏感期干预为调控鲟鱼早期性别分化提供了理论的可能性。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在专利技术一项繁育新技术，专利技术一种调控施氏鲟早期性别分化的方法。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供miR
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34b/c基因抑制剂在调控施氏鲟早期性别分化中的应用。
[0007]优选的，是提供miR
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34b/c基因抑制剂在调控施氏鲟早期性别向雄性方向分化中的应用。
[0008]优选的，所述的miR
‑
34b的序列为：UAGGCAGUGUUGUUAGCUGAUUG；所述的 miR
‑
34c的序列为：AGGCAGUGCAGUUAGUUGAUUAC。
[0009]优选的，所述的基因抑制剂为siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽或抗体中的至少一种。
[0010]本专利技术的第二个目的是提供一种调控施氏鲟早期性别分化的方法，包括以下步骤：对性别分化敏感期的施氏鲟注射miR
‑
34b/c基因抑制剂。
[0011]优选的，所述性别分化敏感期的施氏鲟是指孵化后6月龄的施氏鲟。
[0012]优选的，所述注射是采用双侧多位点注射方式，从尾鳍骨板2
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3之间和5
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6之间注射。
[0013]优选的，所述注射miR
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34b/c基因抑制剂，具体为：交替注射miR
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34b基因抑制剂和 miR
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34c基因抑制剂，每次注射8nmol，一周注射两次，两次之间隔3
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4天，共注射三周。
[0014]本专利技术的第三个目的是提供上述的方法在调控施氏鲟早期性别向雄性方向分化中的应用。
[0015]本专利技术利用miR
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34b/c在施氏鲟早期性别分化进程中显著高表达，并在性腺生殖细胞特异表达，且参与生殖细胞命运调控，进一步在施氏鲟早期性别分化敏感期(6月龄)，建立采用性腺多位点注射miR
‑
34b/c抑制剂方法，显著增加施氏鲟性腺向雄性方向分化的比例，操作方法简单易操作、效果显著，为鲟鱼早期性别分化调控技术提供了新的靶标基因和繁育方法，可促进支持鲟鱼养殖产业的可持续性和绿色健康发展。
[0016]本专利技术为鲟鱼早期性别分化调控技术提供了新的靶标基因和繁育方法。与现有技术相比，本专利技术首次专利技术鲟鱼早期性别分化调控新方法，即在施氏鲟早期性别分化敏感期，采用多位点性腺注射miR
‑
34b/c抑制剂方法，增加施氏鲟早期性别向雄性方向分化的比例，为鲟鱼养殖产业中提供生长速度相对较快的雄性鱼，该方面操作简单易实施，效果显著，值得推广。
附图说明
[0017]图1是miR
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34b和miR
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34c在施氏鲟早期性别分化进程中的表达变化。
[0018]图2是原位杂交技术检测miR
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34c在36月龄卵巢和精巢的表达。
[0019]图3是miR
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34b/c过表达或抑制对施氏鲟生殖细胞增殖检测。
[0020]图4是miR
‑
34b和miR
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34c过表达对施氏鲟生殖细胞的凋亡检测。
[0021]图5是miR
‑
34b/c激动剂或抑制剂性腺注射部位。
[0022]图6是miR
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34b/c激动组(J)或抑制组(Y)中施氏鲟雌性分化(F)和雄性分化(M)的情况。
[0023]图7是miR
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34b/c激动剂和抑制剂性腺注射前后血清中雌二醇和11K
‑
睾酮的变化。
具体实施方式
[0024]以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。
[0025]实施例1
[0026]1、miR
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34b/c在施氏鲟早期性别分化进程中的表达特点。
[0027]采用Real
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time RT
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PCR法，检测miR
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34b(序列：5'
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UAGGCAGUGUUGUUAGCUGAU UG
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3')和miR
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34c(序列：5'
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AGGCAGUGCAGUUAGUUGAUUAC
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3')在施氏鲟早期性别分化进程中(包括四个阶段，即5月龄未分化性腺UGs(性别分化前)和已分化(性别分化后)12月龄、24月龄和36月龄性腺)的时空表达变化。采用RNAiso试剂(TaKaRa,Tokyo,Japan) 分别提取施氏鲟性别分化进程四个发育阶段的性腺组织的总RNA，采用1.5％凝胶电泳和紫外分光仪分别检测总RNA浓度和纯度，合格的总RNA样本(有清晰的28S和18S rRNA条带并且OD 260/280>1.8)进一步用于Real
‑
time PCR实验。每样本分别用200ng的总RNA用特异的miR
‑
34b和miR
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34c特异的茎环引物用于反转录第一链cDNA合成。反应程序：42℃, 60min和70℃,15min。Real
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time 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.miR
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34b/c基因抑制剂在调控施氏鲟早期性别分化中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，是在调控施氏鲟早期性别向雄性方向分化中的应用。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的miR
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34b的序列为：UAGGCAGUGUUGUUAGCUGAUUG；所述的miR
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34c的序列为：AGGCAGUGCAGUUAGUUGAUUAC。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的应用，其特征在于，所述的基因抑制剂为siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽或抗体中的至少一种。5.一种调控施氏鲟早期性别分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：对性别分化敏感期的施氏鲟注射miR

【专利技术属性】
技术研发人员：张秀娟，陈金平，吴文化，俞也频，江海英，韩勍，李林妙，周佳滨，
申请(专利权)人：广东省科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：