小鼠血栓的检测方法及植物乳杆菌对血栓形成的抑制作用技术

本发明专利技术提供小鼠血栓的检测方法及植物乳杆菌对血栓形成的抑制作用，属于血栓治疗领域，该小鼠血栓的检测方法具体步骤为材料与试剂，仪器与设备，动物实验，凝血四项检验，血清和组织炎症细胞因子测定，组织切片检测，组织mRNA表达检测，小鼠粪便中微生物mRNA表达的测定和统计学分析。本发明专利技术LP

【技术实现步骤摘要】
小鼠血栓的检测方法及植物乳杆菌对血栓形成的抑制作用


[0001]本专利技术属于血栓治疗领域，尤其涉及小鼠血栓的检测方法及植物乳杆菌对血栓形成的抑制作用。

技术介绍

[0002]我国的新疆地区幅员辽阔，拥有大量优质牧场，畜牧业发达。同时，新疆地区的少数民族众多，各个少数民族都有自己较为独特的饮食习惯，但是大部分均有食用奶制品的习惯，包括牧民家庭制作的自然发酵酸乳也是最常食用的奶制品之一。因新疆少数民族牧民居住区域独特的地理环境和自然发酵方式，与市售普通的工业化生产酸奶相比，新疆自然发酵酸乳的制作过程中生产的酸奶更加生态、自然，其中的微生物多样性也更加丰富，酸乳具有的营养价值及保健功能更加突出。特别是这些自然发酵乳制品中的微生物经过上千年的自然驯化，已经适应了新疆的生存环境并且拥有不同的发酵特性及益生功能，极具开发利用价值。
[0003]经济发展促进国民生活水平提高，随之也使人们的饮食结构发生变化，大量不健康的食品摄入造成了包括心脑血管疾病已在内的多种慢性疾病，严重威胁中老年人的身体健康。心脑血管疾病在发病前多数没有显著的症状，一旦发病病情突然且严重，及时救治困难，严重威胁患者的生命。内源性或外源性的损伤都会引发复杂的防御反应，从而导致机体发生炎症反应。炎症同样是诱发血栓形成的一个重要因素，同时血栓形成又会进一步促使炎症的加剧。血栓能对机体器官造成一定的损伤，随着后续炎症和血栓程度的加剧，机体器官的损伤也会随之加剧。严重的血栓能引起的复杂的炎症，导致全身多个器官，包括肝脏和肾脏的功能障碍和组织坏死。炎症状态下大量的促炎因子促使血液处于高凝状态，从而引起血栓的形成；血栓又是加剧机体炎症发生和发展的因素，炎症和血栓的交互作用又形成复杂的网络，造成包括心脑血管器官和组织的严重损伤。角叉菜胶能引起实验动物体内发生炎症反应，动物体内出现大量炎症因子后这些因子会快速进入血液循环中，从而引发血管内皮细胞损伤或死亡，并最终引起血栓的形成。
[0004]现有技术特别是实验小鼠的鼠尾血管是单循环血管，发生血栓后无法通过侧支循环进行血液循环，因此鼠尾组织将逐渐缺血，造成组织坏死。
[0005]但是，现有的对血栓形成的抑制作用存在着不适合于各类人群，血栓抑制效果差和植物乳杆菌形成不稳定的问题。
[0006]因此，专利技术小鼠血栓的检测方法及植物乳杆菌对血栓形成的抑制作用显得非常必要。

技术实现思路

[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提供小鼠血栓的检测方法及植物乳杆菌对血栓形成的抑制作用，本专利技术是通过以下技术方案得以实现的：
[0008]小鼠血栓的检测方法具体包括以下步骤：
[0009]步骤一：材料与试剂，植物乳杆菌KSFY04分离自然发酵酸牛乳，SPF级六周龄的雄性昆明小鼠，体重为23
±
2g；TNF
‑ꢀ
α、IL
‑
6和IL
‑
1β检测试剂盒；TRIzol试剂； SYBRGreenPCRMasterMix、qpCR引物；其余试剂均为国产分析纯；
[0010]步骤二：仪器与设备，PUN
‑
2048A半自动血凝仪，BX43 显微镜，VarioskanLUX多功能酶标仪，StoponePlus定量PCR 仪；
[0011]步骤三：动物实验，小鼠饲养在温度为20
±
1℃和湿度为 30％～40％的环境下，实验小鼠可自由采食和饮水，小鼠适应性喂养7d后正式开始进行实验；
[0012]步骤四：凝血四项检验，将收集到的小鼠心脏血采用半自动血凝仪测量活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间 (TT)、纤维蛋白原(FIB)和凝血酶原时间(PT)；
[0013]步骤五：血清和组织炎症细胞因子测定，将收集到的小鼠心脏血在1500rpm和4℃下进行离心分离10min，去上层血清待用；同时称取0.1g肾脏和肝脏组织，然后向肾脏和肝脏组织中分别加入0.9mL生理盐水，然后在4000rpm和4℃下进行对组织进行均质10min，离心后收集上清液待用；最后按检测试剂盒方法测定血清和组织中的TNF
‑
α、IL
‑
6和IL
‑
1β炎症细胞因子水平；
[0014]步骤六：组织切片检测，解剖小鼠后，将小鼠的肾脏、肝脏和尾部组织用10％福尔马林固定；脱水48h后，将组织样品包埋在石蜡中，进行切片，并用苏木精
‑
伊红(H&E)染色；最后用光学显微镜观察组织的病理变化；
[0015]步骤七：组织mRNA表达检测，分别称取0.1g小鼠尾静脉组织，在组织中加入0.9mL生理盐水进行匀浆，再加入1.0mL 的RNAzol提取小鼠尾静脉组织中的RNA；然后观察；
[0016]步骤八：小鼠粪便中微生物mRNA表达的测定，称取1.0g 小鼠的粪便，根据1.3.5组织mRNA测定方法测定小鼠粪便中微生物的mRNA表达，以检测粪便中微生物的组成；
[0017]步骤九：统计学分析，所有实验进行三次平行测定，测定得到的结果以平均值表示，并计算出标准偏差，实验结果表示为平均值
±
标准偏差；同时采用单因素方差分析计算各组数据之间是否具有显著差异(P<0.05)。
[0018]优选的，在步骤三中，所述的小鼠采取50只昆明小鼠随机分为5组，每组10只，分别为正常组、模型组、药物阳性对照组、LP
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KSFY04低浓度处理(LP
‑
KSFY04
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L)组和LP
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KSFY04 高浓度处理(LP
‑
KSFY04
‑
H)组；正常组小鼠每天按计量 0.01mL/g腹腔注射生理盐水溶液，其余各组小鼠每日按照 0.01mL/g计量腹腔注射0.2％浓度的角叉菜胶溶液，持续10天；同时，药物阳性对照组小鼠每日按计量20mg/kg灌胃双嘧达莫，LP
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KSFY04
‑
L组和LP
‑
KSFY04
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H组小鼠每日按 108CFU/kgand109CFU/kg的计量灌胃LP
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KSFY04，双嘧达莫和 LP
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KSFY04的灌胃同样持续10天；10天后对小鼠实施断颈处死后，记录各组小鼠尾部黑尾(血栓)长度，同时解剖取小鼠心脏血和内脏待测。
[0019]优选的，在步骤七中，所述的观察方式采用使用超微分光光度法在260nm和280nm处测定提取到RNA的吸光度值，计算RNA纯度和浓度，将RNA浓度调整为1μg/μL；然后通过反转录生成cDNA后，配制含1μLcDNA的反应体系，其余试剂包括10μLSYBRGreenPCRMasterMix、7μL无菌蒸馏水和上下游各1μL引物溶液；在定量PCR仪中进行反应，反应条件为95℃持续60s；95℃持续15s，进行40个循环；55℃持续30s； 72℃持续35本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.小鼠血栓的检测方法，其特征在于，小鼠血栓的检测方法具体包括以下步骤：步骤一：材料与试剂，植物乳杆菌KSFY04分离自然发酵酸牛乳，SPF级六周龄的雄性昆明小鼠，体重为23
±
2g；TNF
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α、IL
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6和IL
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1β检测试剂盒；TRIzol试剂；SYBRGreenPCRMasterMix、qpCR引物；其余试剂均为国产分析纯；步骤二：仪器与设备，PUN
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2048A半自动血凝仪，BX43显微镜，VarioskanLUX多功能酶标仪，StoponePlus定量PCR仪；步骤三：动物实验，小鼠饲养在温度为20
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1℃和湿度为30％～40％的环境下，实验小鼠可自由采食和饮水，小鼠适应性喂养7d后正式开始进行实验；步骤四：凝血四项检验，将收集到的小鼠心脏血采用半自动血凝仪测量活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)和凝血酶原时间(PT)；步骤五：血清和组织炎症细胞因子测定，将收集到的小鼠心脏血在1500rpm和4℃下进行离心分离10min，去上层血清待用；同时称取0.1g肾脏和肝脏组织，然后向肾脏和肝脏组织中分别加入0.9mL生理盐水，然后在4000rpm和4℃下进行对组织进行均质10min，离心后收集上清液待用；最后按检测试剂盒方法测定血清和组织中的TNF
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α、IL
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6和IL
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1β炎症细胞因子水平；步骤六：组织切片检测，解剖小鼠后，将小鼠的肾脏、肝脏和尾部组织用10％福尔马林固定；脱水48h后，将组织样品包埋在石蜡中，进行切片，并用苏木精
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伊红(H&E)染色；最后用光学显微镜观察组织的病理变化；步骤七：组织mRNA表达检测，分别称取0.1g小鼠尾静脉组织，在组织中加入0.9mL生理盐水进行匀浆，再加入1.0mL的RNAzol提取小鼠尾静脉组织中的RNA；然后观察；步骤八：小鼠粪便中微生物mRNA表达的测定，称取1.0g小鼠的粪便，根据1.3.5组织mRNA测定方法测定小鼠粪便中微生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵欣，
申请(专利权)人：重庆第二师范学院，
类型：发明
国别省市：