抗原抗体特异性结合识别方法技术

本公开涉及了用于同时检测抗原和抗原特异性抗体的方法。LIBRA

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗原抗体特异性结合识别方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年9月4日提交的美国临时专利申请序列号62/895687和2019年10月10日提交的美国临时专利申请序列号62/913432的权益，其公开内容通过明确引用并入本文。
[0003]关于联邦资助研究的声明
[0004]本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的第R01 AI131722号拨款的政府支持下完成的。政府对本专利技术享有一定的权利。
[0005]引用序列表
[0006]序列表于2020年9月4日提交，作为文本文件命名为“10644_104WO1_Sequence_Listing”，创建于2020年9月4日，大小为676342字节，在此通过引用并入。


[0007]本公开涉及用于从基于测序的读出中识别抗原结合信号和确定抗体序列
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抗原特异性关联的方法。

技术介绍

[0008]抗体文库
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个体中存在的抗体的集合
‑
由于其独特的多样性和通过体细胞超突变微调抗原特异性的能力，对入侵的病原体做出了有效的反应(Briney等人，2019；Rajewsky，1996；Soto等人，2019)。这种抗体文库是潜在治疗剂的丰富来源，但它的大小使得很难研究全部文库的一小部分(Brekke和Sandlie，2003；Georgiou等人，2014；Wang等人，2018；Wilson和Andrews，2012)。从历史上看，已经开发了多种方法来表征人类感染和接种疫苗样本中的抗原特异性B细胞。最常用的方法包括使用荧光抗原诱饵进行单细胞分选(Scheid等人，2009；Wu等人，2010)、永生化B细胞筛选(Buchacher等人，1994；Stiegler等人，2001)和B细胞培养(Bonsignori等人，2018；Huang等人，2014；Walker等人，2009，2011)。然而，这些将功能筛选与可变重链(VH)和可变轻链(VL)免疫球蛋白基因序列偶联的方法通量低；通常，单个B细胞只能同时针对几种抗原进行筛选。需要用于同时检测抗原和抗原特异性抗体的高通量系统和方法。

技术实现思路

[0009]在一些方面，本文公开了一种同时检测抗原和特异性结合所述抗原的抗体的方法，其包括：
[0010]用独特的抗原条形码标记多个抗原；
[0011]向B细胞群提供多个条形码标记的抗原；
[0012]允许多个条形码标记的抗原与b细胞群结合；
[0013]从B细胞群中冲洗未结合的抗原；
[0014]将B细胞分离成单细胞乳液；
[0015]在每个单细胞乳液中引入独特的细胞条形码标记的珠子；
[0016]从单细胞乳液中制备单细胞cDNA文库；
[0017]进行PCR扩增反应，产生多个扩增子，其中所述扩增子包括：1)细胞条形码和抗原条形码，2)细胞条形码和抗体序列，和3)唯一的分子标识符(UMI)；
[0018]对多个扩增子测序；
[0019]除去缺少细胞条形码、UMI或抗原条形码的序列；
[0020]将抗体序列与免疫球蛋白V、D、J和C序列的参考文库比对；
[0021]构建包含细胞条形码、抗原条形码和抗体序列的UMI计数矩阵；
[0022]确定LIBRA
‑
seq评分；和
[0023]与对照样品相比，如果抗体对抗原的LIBRA
‑
seq评分增加，则确定抗体特异性结合抗原。
[0024]在一些实施方案中，条形码标记的抗原用包含DNA序列或RNA序列的第一条形码标记。在一些实施方案中，细胞条形码标记的珠子用包含DNA序列或RNA序列的第二条形码标记。
[0025]在一些实施方案中，抗体序列包含免疫球蛋白重链(VDJ)序列，或免疫球蛋白轻链(VJ)序列。
[0026]在一些实施方案中，条形码标记的抗原包括来自病原体或动物的抗原。在一些实施方案中，来自病原体的抗原包括来自病毒的抗原。在一些实施方案中，来自病毒的抗原包括人类免疫缺陷病毒(HIV)的抗原、来自流感病毒的抗原或来自呼吸道合胞病毒(RSV)的抗原。
[0027]在一些实施方案中，任何前述方面的方法还包括确定特异性结合抗原的抗体的体细胞超突变水平。
[0028]在一些实施方案中，任何前述方面的方法还包括确定特异性结合抗原的抗体的互补决定区(CDR)的长度。
[0029]在一些实施方案中，任何前述方面的方法还包括确定抗体特异性结合抗原的CDR模体。在一些实施方案中，CDR选自CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、CDRL3。
[0030]在另外一方面，本文公开了一种确定对病原体的广泛中和抗体的方法，所述方法包括：
[0031]用独特的抗原条形码标记来自病原体的多种抗原；
[0032]向B细胞群提供多个条形码标记的抗原；
[0033]允许多个条形码标记的抗原与b细胞群结合；
[0034]从B细胞群中冲洗未结合的抗原；
[0035]将B细胞分离成单细胞乳液；
[0036]在每个单细胞乳液中引入独特的细胞条形码标记的珠子；
[0037]从单细胞乳液中制备单细胞cDNA文库；
[0038]进行PCR扩增反应，产生多个扩增子，其中所述扩增子包括：1)细胞条形码和抗原条形码，2)细胞条形码和抗体序列，和3)唯一的分子标识符(UMI)；
[0039]对多个扩增子测序；
[0040]除去缺少细胞条形码、唯一分子标识符(UMI)或抗原条形码的序列；
[0041]将抗体序列与免疫球蛋白V、D、J和C序列的参考文库比对；
[0042]构建包含细胞条形码、抗原条形码和抗体序列的UMI计数矩阵；
[0043]确定LIBRA
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seq评分；和
[0044]与对照相比，如果两种或多于两种抗原的抗体的LIBRA
‑
seq评分增加，则确定该抗体是广泛中和抗体。
[0045]在一些方面，本文公开的是包括在说明书中阐述的序列的多核苷酸。
[0046]在一些方面，本文公开了一种多肽，其中所述多肽由说明书中阐述的多核苷酸序列编码。
[0047]在一些方面，本文公开的多核苷酸包括在图2或图3中列出的序列。
[0048]在一些方面，本文公开的是包含任何前述方面的多肽的治疗性抗体。
附图说明
[0049]并入并构成本说明书一部分的附图说明了以下描述的方面。
[0050]图1.LIBRA
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seq测定示意图和验证。(A)LIBRA
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seq测定示意图。荧光标记、DNA条形码抗原用于分选抗原阳性B细胞，然后使用液滴微流体将单个B细胞与珠状递送的寡核苷酸共封装。珠状递送的寡核苷酸在逆转录过程中同时索引细胞BCR转录物和抗原条形码，从而能够在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种同时检测抗原和特异性结合所述抗原的抗体的方法，其包括：用独特的抗原条形码标记多个抗原；向B细胞群提供多个条形码标记的抗原；允许多个条形码标记的抗原与B细胞群结合；从B细胞群中冲洗未结合的抗原；将B细胞分离成单细胞乳液；在每个单细胞乳液中引入独特的细胞条形码标记的珠子；从单细胞乳液中制备单细胞cDNA文库；进行PCR扩增反应，产生多个扩增子，其中所述扩增子包括：1)细胞条形码和抗原条形码，2)细胞条形码和抗体序列，和3)唯一的分子标识符(UMI)；对多个扩增子测序；除去缺少细胞条形码、UMI或抗原条形码的序列；将抗体序列与免疫球蛋白V、D、J和C序列的参考文库比对；构建包含细胞条形码、抗原条形码和抗体序列的UMI计数矩阵；确定LIBRA
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seq评分；和与对照样品相比，如果抗体对抗原的LIBRA
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seq评分增加，则确定抗体特异性结合抗原。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述条形码标记的抗原用包含DNA序列或RNA序列的第一条形码标记。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞条形码标记的珠子用包含DNA序列或RNA序列的第二条形码标记。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中抗体序列包括免疫球蛋白重链(VDJ)序列，或免疫球蛋白轻链(VJ)序列。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述条形码标记的抗原包括来自病原体或动物的抗原。6.根据权利要求5所述的方法，其中来自病原体的抗原包括来自病毒的抗原。7.根据权利要求6所述的方法，其中来自病毒的抗原包括来自人类免疫缺陷病毒(HIV)的抗原、来自流感病毒的抗原或来自呼吸道合胞病毒(RSV)的抗原。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其还包括确定特异性结合抗原的抗体的体细胞超突变水平。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其还包括确定特异性结合抗原的抗体的互补决定区域(CDR)的长度。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其还包括确定特异性结合抗原的抗体的CDR的基序。11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述CDR选自CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、CDRL3。12.一种确定对病原体的广泛中和抗体的方法，所述方法包括：...

【专利技术属性】
技术研发人员：马里恩，
申请(专利权)人：范德比尔特大学，
类型：发明
国别省市：