一种用于冷凝集血常规标本检测的试剂及其检测方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开了一种用于冷凝集血常规标本检测的试剂及其检测方法和应用。所述试剂包括巯基化合物和蛋白酶，所述巯基化合物在试剂中的浓度大于0.00125mol/L，所述蛋白酶在试剂中的浓度大于0.025％。本发明专利技术利用巯基化合物破坏IgM抗体二硫键使其失活，以及蛋白酶水解IgA和IgG铰链区二硫键使其裂解的特性，配制出一种试剂(简称MP)，用于临床血常规检测，彻底解决了水浴法、生理盐水置换法及双重加温预稀释法等不能有效灭活冷凝集素、操作过程中血细胞丢失、操作繁琐等缺点。本发明专利技术的检测方法解决了早期技术无法有效灭活冷凝集素的缺点，而且具有无血细胞无丢失和破坏、准确度高、操作简便等优点。操作简便等优点。操作简便等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种用于冷凝集血常规标本检测的试剂及其检测方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种用于冷凝集血常规标本检测的试剂及其检测方法和应用。

技术介绍

[0002]冷凝素可见于原发性冷凝集素病(cold agglutinin disease，CAD)或继发性冷凝集素综合征(cold agglutinin syndrome，CAS)。多数CAD病例会产生单克隆冷凝集素，多见于淋巴细胞增殖性疾病或淋巴系统恶性肿瘤，患者体内的冷凝集素一般维持在较高效价(＞1000)；继发性CAS多见于感染和自身免疫性疾病，如支原体肺炎、传染性单核细胞增多症、系统性红斑狼疮及类风湿性关节炎等。
[0003]血常规标本的冷凝集是由冷凝集素引起的红细胞凝集成团的现象，在平时检验工作中经常遇到，这种现象对血常规的检测产生很大干扰，严重影响了实验结果的准确性。冷凝集素是一类针对红细胞抗原的自身抗体，主要为IgM型，少数为IgA型、IgG型或混合型。冷凝集标本血细胞聚集程度与冷凝集素效价呈正相关(冷凝集素效价＞1∶64具有临床意义)，冷凝集素的聚集能力与温度呈负相关，随着温度升高聚集能力降低，部分低效价的冷凝集素在37℃时凝集活性可减弱或消失，但高效价的冷凝集素在37℃甚至43℃仍可有较强的凝集力，此时，常见处理方法如水浴法、生理盐水置换法及双重加温预稀释法等，具体处理方法包括：(1)水浴法：将标本置于37℃水浴箱孵育30min后，混匀后立即上机检测。(2)生理盐水置换法：将2mL EDTA抗凝血3000r/min离心10min，用加样枪插至上清液与血细胞交界面上3mm处，将上层血浆(远离白细胞和血小板所在白膜层)缓慢定量取出弃掉，记录血浆量；将0.9％生理盐水10mL，置于37℃水浴箱孵育0.5h，加入与血浆量等量生理盐水，3000r/min离心10min，以相同方法置换3次或5次，混匀后上机检测。(3)双重加温预稀释法：取洁净试管加入LH Series Diluent稀释液700μL与患者标本一同置于37℃水浴箱孵育30min。孵育结束后，立即吸取100μL血液与稀释液充分混匀，在仪器1∶7预稀释模式下进行检测。
[0004]但是目前的水浴法、生理盐水置换法还是双重加温预稀释法均不能有效破坏血浆中的冷凝集素，也无法有效解离已结合在血细胞表面的冷凝集素，尤其是对于一些高效价、高亲和力的冷激素，纠正相关参数的能力有限。并且在生理盐水或血浆置换法进行试验时，生理盐水或血浆置换过程中极易造成白细胞及血小板的丢失，使其结果偏低，而置换次数越多，丢失现象越明显，严重影响了检测结果的准确性。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的针对水浴法、生理盐水置换法及双重加温预稀释法等不能有效灭活冷凝集素、操作过程中血细胞丢失、操作繁琐等缺点而提供一种用于冷凝集血常规标本检测的试剂及其检测方法和应用，本专利技术利用巯基化合物破坏IgM抗体二硫键使其失活，以及蛋白酶水解IgA和IgG铰链区二硫键使其裂解的特性，配制出一种试剂(简称MP)，用于临床血常规检测，彻底解决了上述技术难题。本专利技术的检测方法解决了早期技术无法有效灭活
冷凝集素的缺点，而且具有无血细胞无丢失和破坏、准确度高、操作简便等优点。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0007]本专利技术提供了一种用于冷凝集血常规标本检测的试剂，所述试剂包括巯基化合物和蛋白酶，所述巯基化合物在试剂中的浓度大于0.00125mol/L，所述蛋白酶在试剂中的浓度大于0.025％。
[0008]IgM分子由5个轴射状排列的亚单位组成，亚基间以二硫键相连，亚基间的二硫键比亚基内链间与链内二硫键容易被巯基试剂破坏，经巯基试剂处理后，IgM失去原来的血清学性质。本专利技术使用巯基化合物破坏IgM分子亚基间二硫键，使IgM抗体失活，具有专一的特异性，只中和IgM抗体而不破坏IgG抗体。本专利技术还使用蛋白酶水解IgA和IgG铰链区二硫键，当酶活性中心的氨基酸残基被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸(或亚硫酸盐)或EDTA能恢复酶的活力，蛋白酶水解Ig的部位是在铰链区二硫键连接的两条重链的近N端，可将IgA和IgG裂解为两个完全相同的Fab段和一个Fc段。因此，按照相应的比例将巯基化合物和蛋白酶配制成上述浓度的试剂，可有效灭活血浆中的所有类型冷凝集素，如IgM型、IgA型、IgG型及混合性。
[0009]作为本专利技术所述用于冷凝集血常规标本检测的试剂的优选实施方式，所述巯基化合物为二巯基乙醇。
[0010]作为本专利技术所述用于冷凝集血常规标本检测的试剂的优选实施方式，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶。
[0011]当巯基化合物及蛋白酶选用上述种类时，可以更好地有效灭活血浆中的所有类型冷凝集素，克服了水浴法、生理盐水置换法及双重加温预稀释法等不能有效灭活冷凝集素、操作过程中血细胞丢失、操作繁琐等缺点。
[0012]其中，木瓜蛋白酶是一种由212个氨基酸残基组成单肽链蛋白水解酶，可将IgA和IgG裂解为两个完全相同的Fab段和一个Fc段；当二巯基乙醇和木瓜蛋白酶复配时，可以有效灭活冷凝集素的缺点，而且具有无血细胞无丢失和破坏、准确度高、操作简便等优点。
[0013]本专利技术首次提出将二巯基乙醇和木瓜蛋白酶组合，以破坏血液标本中的冷凝集素，用于血常规标本的检测。
[0014]作为本专利技术所述用于冷凝集血常规标本检测的试剂的优选实施方式，所述巯基化合物在试剂中的浓度为0.00125～0.02mol/L，所述蛋白酶在试剂中的浓度为0.025～0.4％。
[0015]作为本专利技术所述用于冷凝集血常规标本检测的试剂的优选实施方式，所述巯基化合物在试剂中的浓度为0.0025～0.02mol/L，所述蛋白酶在试剂中的浓度为0.05～0.4％。
[0016]更优选地，所述巯基化合物在试剂中的浓度为0.005mol/L，所述蛋白酶在试剂中的浓度为0.1％。
[0017]当巯基化合物、蛋白酶以上述浓度配合时，可以完全纠正冷凝集素引起的血常规异常，同时无血细胞丢失和破坏、检测结果更准确。
[0018]本专利技术提供了一种用于冷凝集血常规标本检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的试剂。
[0019]本专利技术还提供了一种上述试剂或试剂盒在检测血常规标本中的应用，所述应用包括以下步骤：
[0020]1)将待测标本与上述的试剂混合进行裂解处理，孵育；
[0021]2)孵育后，加入血常规标本稀释液，上机检测。
[0022]所述血常规标本稀释液包括上述的试剂和稀释液。
[0023]优选地，步骤1)的具体步骤为：
[0024]将待测标本与上述的试剂混合进行裂解置于37℃孵育30min，期间震荡摇匀3次。
[0025]该方法首先将待测标本与试剂混悬液，37℃水浴30min，当待测标本中冷凝集素灭活后，无需洗涤和离心，加入血常规标本稀释液(可根据仪器稀释倍数选择)混匀后，即可直接上机检测。该方法解决了早期本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于冷凝集血常规标本检测的试剂，其特征在于，所述试剂包括巯基化合物和蛋白酶，所述巯基化合物在试剂中的浓度大于0.00125mol/L，所述蛋白酶在试剂中的浓度大于0.025％。2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述巯基化合物为二巯基乙醇。3.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶。4.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述巯基化合物在试剂中的浓度为0.00125～0.02mol/L，所述蛋白酶在试剂中的浓度为0.025～0.4％。5.如权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述巯基化合物在试剂中的浓度为0.0025～0.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：苑召虎，陈振宇，李荣新，周振雅，张慧，田重阳，
申请(专利权)人：广州市第一人民医院广州消化疾病中心，广州医科大学附属市一人民医院，华南理工大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：