促进人γδT细胞体外增殖与增强其细胞毒活性的方法技术

本发明专利技术属于医药技术领域，公开了促进人γδT细胞体外增殖与增强其细胞毒活性的方法。单次0.08 Gy电离辐射能够显著促进体外人γδT细胞增殖能力，获得体外增殖2倍以上的人γδT细胞；单次2 Gy电离辐射能够显著增强人γδT细胞对肝癌HepG2细胞的肿瘤杀伤活性，获得体外对肝癌HepG2细胞的杀伤活性为45%以上的人γδT细胞，其机制与电离辐射促进人γδT细胞穿孔素、颗粒酶B及溶酶体相关膜蛋白

【技术实现步骤摘要】
modulating mTOR pathway and APC function.J Immunother Cancer,2021,9(12):e003339.]。
[0004]电离辐射(ionizing radiation)是指会引起物质电离，破坏原子或分子结构的辐射。一般认为，接受长时间或较高强度的电离辐射会危害机体健康，导致器官和系统发生病理改变，引起放射病，甚至具有诱导癌症发生的可能性。近年来，电离辐射诱导免疫激活的现象逐渐引起科研人员的兴趣，其潜在的控制肿瘤的作用及其机制已成为研究热点。研究表明，较低剂量辐射不仅不会损害机体的免疫功能，反而能够正向调节免疫系统，抑制和延缓原发或转移性肿瘤的进展[Yu HS, Liu ZM,Yu XY,et al.Low
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dose radiation induces antitumour effects and erythrocytesystem hormesis.Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(7):4121
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4126.NowosielskaEM,Cheda A,Wrembel
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Wargocka J,et al.Effect of low doses of low
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let radiation onthe innate anti
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tumor reactions in radioresistant and radiosensitive mice.DoseResponse,2012,10(4):500
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515.]；上调免疫系统的固有和适应性免疫能力是其重要机制之一[Yang G,Kong Q,Wang G,Jin H,et al.Low
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Dose Ionizing RadiationInduces Direct Activation of Natural Killer Cells and Provides a Novel Approach forAdoptive Cellular Immunotherapy.Cancer Biother Radiopharm,2014,29(10): 428
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434.]。
[0005]当前，放射治疗作为肿瘤治疗的重要手段广泛应用于临床，电离辐射可通过直接诱导肿瘤细胞死亡和调节表型等机制发挥其增强抗肿瘤免疫效能。研究表明，电离辐射可导致调节性T细胞Foxp3表达下调从而减弱其对CD8
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T细胞增殖的抑制效果[Persa E,Balogh A,S
á
fr
á
ny G,et al.The effect of ionizing radiationon regulatory T cells in health and disease.Cancer Lett,2015,368(2):252
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261.]。低剂量辐射体内可增加抗氧化基因的表达，下调促炎细胞因子白细胞介素1β (interleukin 1β，IL
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1β)、IL
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6和肿瘤坏死因子
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α(tumor necrosis factor，TNF
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α表达，增加伤口愈合能力[Son B,Lee S,Kim H,et al.Low dose radiation attenuatesinflammation and promotes wound healing in a mouse burn model.Dermatol Sci, 2019,96(2):81
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89.]，还可以刺激机体正常细胞增殖，激活其防御系统，减少对正常组织的损伤，诱导适应性反应发生，从而减少高剂量放疗对机体免疫系统的损伤，增加对微小肿瘤的清除，降低癌症发生率[Paunesku,Stevanovi A,PopoviJ,et al.Effects of low dose and low dose rate low linear energy transfer radiation onanimals
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review of recent studies relevant for carcinogenesis[J].Int J Radiat Biol, 2021,97(6):757
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768.]；同时还具有增强癌症治疗效果和减少抗癌治疗毒副作用的潜力等[Yang G,Li W,Jiang H,et al.Low
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dose radiation may be a novel approachto enhance the effectiveness of cancer therapeutics.Int J Cancer,2016,139(10): 2157
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2168.]。低剂量辐射体外可激活NK细胞功能，显著增强NK细胞的扩增和细胞毒活性[Chen J,Liu X,Zeng Z,et al.Immunomodulation of NK Cells byIonizing Radiation.Front Oncol,2020,10:874.Yang G,Kong Q,Wang G,et al. Low
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dose ionizing radiation induces direct activation of natural killer cells andprovides a novel approach for adoptive cellular immunotherapy.Cancer BiotherRadiopharm,2014,29(10):428
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434.]。
[0006]由于人γδT细胞是肿瘤患者肿瘤免疫治疗中重要的抗肿瘤效应细胞，故有效促进
人γδT细胞增殖、增强其细胞毒活性是十分重要和必要的。既往实验主要进行以整体动物或动物细胞为模型的不同剂量电离辐射作用的研究，而电离辐射能否对人γδT细胞产生影响未见报道。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供一种促进人γδT细胞体外增殖与增强其细胞毒活性的方法。
[0008]本专利技术的技术方案包括如下内容：一种促进人γδT细胞体外增殖与增强其细胞毒活性的方法，包括如下步骤：
[0009](1)无菌采集健康人外周血20ml，抗凝处理后，密度梯度离心获取外周血单个核细胞，经磷酸盐缓冲液洗涤后加入至GT551 H3无血清培养基中，形成初始细胞密度为1
×
106/ml的细胞溶液，置于37℃、5％CO2环境下的细胞培养箱中培养，隔日补充完全培养基；
[0010](2)将步骤(1)中的人γδT细胞培养10天后，收集少量细胞经磷酸盐缓冲液洗涤后，与FITC标记的抗人γδTCR单抗在室温下避光孵育15min，再次使用磷酸盐缓冲液洗涤后经检测收集本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进人γδT细胞体外增殖与增强其细胞毒活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）无菌采集健康人外周血20 ml，抗凝处理后，密度梯度离心获取外周血单个核细胞，经磷酸盐缓冲液洗涤后加入至GT551 H3无血清培养基中，形成初始细胞密度为1
×
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6 /ml的细胞溶液，置于37
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C、5%CO2环境下的细胞培养箱中培养，隔日补充完全培养基；（2）将步骤（1）中的人γδT细胞培养10天后，收集少量细胞经磷酸盐缓冲液洗涤后，与FITC标记的抗人γδTCR单抗在室温下避光孵育15 min，再次使用磷酸盐缓冲液洗涤后经检测收集扩增效率达80%以上的人γδT细胞，经磷酸盐缓冲液洗涤2遍后悬浮于含0.5%牛血清白蛋白、2 mmol/L 乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液中，采用抗人γδTCR单抗包被的磁珠阳性分选人γδT细胞；（3）取步骤（2）中分选纯化后的人γδT细胞，将分选纯化后的人γδT细胞按1
×
10
7 /ml的细胞密度转移至6孔细胞培养板中，每孔3 ml，采用直线加速器治疗机，于室温条件下以6 MV X线分别给予0.08 Gy进行辐射，机架GA为270
°
，源皮距SSD =500 cm，辐射野10 cm
ꢀ×
10 cm，剂量率为0.08 Gy/min，输出量为2 Gy/min，培养皿前覆盖1.5 cm等效填充物，结束后置于37
°
C、5%CO2环境下的细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：王路路，冯守信，周忠海，陈玲，杨阳，马文青，赵海泉，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：