一种提神醒脑药物筛选的方法和车叶草苷在提神醒脑方面中的应用技术

本发明专利技术公开了提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b在筛选提神醒脑药物中的应用，涉及药物筛选技术领域，具体为基于行为学指标和上述提神醒脑标志基因进行提神醒脑药物筛选的方法，包括以下步骤：

【技术实现步骤摘要】
一种提神醒脑药物筛选的方法和车叶草苷在提神醒脑方面中的应用


[0001]本专利技术涉及药物筛选
，具体说是一种提神醒脑药物筛选的方法和车叶草苷在提神醒脑方面中的应用，其中筛选是基于行为学指标和提神醒脑标志基因进行。

技术介绍

[0002]目前药物筛选的方法主要包括分子水平筛选、虚拟筛选、细胞水平筛选和动物模型药物筛选等，其中分子水平筛选筛选有效的药物与目的蛋白结合强，但是在细胞环境中却可能无法发挥作用；虚拟筛选是指通过计算机模拟已知靶点和药物结构之间的相互作用，筛选出可能有效的药物，成本低、速度快，但是筛选出的药物还需要进一步的生物实验进行验证；细胞水平筛选是指用候选药物处理靶细胞，再通过生化实验检验药物对靶细胞的作用，筛选得到的药物虽然能够有效地作用于靶细胞，但是实验流程复杂，对实验环境的要求高，且无法评估药物对整体生物是否有毒副作用，因此也限制了其使用；动物模型药物筛选一般需建立猴等灵长类动物模型、猪和小鼠模型，但是动物疾病模型构建过程是一个巨大的工程，需要系统的理论和复杂的技术手段才能获得有效构建，对动物的生长环境有严格的要求。
[0003]斑马鱼由于和人类基因同源性高，各组织器官在受精后24小时即可形成，发育周期短，个体小等优势，为其作为筛选活性药物的动物模型提供了可能。目前对于提神醒脑药物还没有科学、快速有效的筛选方法。

技术实现思路

[0004]为解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种提神醒脑药物筛选的方法和车叶草苷在提神醒脑方面中的应用，其中筛选是基于行为学指标和提神醒脑标志基因进行。
[0005]本专利技术为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
[0006]提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b在筛选提神醒脑药物中的应用。
[0007]本专利技术还包括基于行为学指标和权利要求1所述的提神醒脑标志基因进行提神醒脑药物筛选的方法，包括以下步骤：
[0008]①
确定待筛选药物和对照药咖啡因对斑马鱼幼鱼的最大安全浓度；
[0009]②
基于光照刺激反应下的斑马鱼行为学表现，筛选提神醒脑药物：
[0010]实验当晚24时，将5dpf的斑马鱼幼鱼转移至48孔板中，每孔一条鱼，将上述斑马鱼幼鱼分为对照药物组、空白组和若干实验组，其中对照药物组加入最大安全浓度的咖啡因，空白组加入1mL新鲜养鱼水，每个实验组加入1mL最大安全浓度的一种待筛选药物；每组均设置三个平行试验；
[0011]将上述48孔板放入Zebrabox斑马鱼行为分析仪暗箱中，开始检测斑马鱼对光照刺激反应，检测时间为60分钟，每分钟记录一次数据，运用Zeblab软件进行数据处理，计算斑马鱼游动总距离和游动速度，测试不同组别斑马鱼在沉睡时间下的光照刺激反应；
[0012]③
基于Real
‑
time PCR技术，检测各组提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b的表达水平，筛选出提神醒脑药物：
[0013]对提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b设计引物序列：
[0014]nr1d4a
‑
RT
‑
F：AGATATCGCATCAGGGTTCC，
[0015]nr1d4a
‑
RT
‑
R：CTCGTTCTTCACGCACATCT，
[0016]nr1d4b
‑
RT
‑
F：ATCAGGTCATGCTGCTGAAG，
[0017]nr1d4b
‑
RT
‑
R：GCGTTCCTTAGCATTGAACA，
[0018]收集不同处理组行为学记录后的斑马鱼，用养鱼水清洗两到三次，转移至离心管中，高速离心后吸干上层液体，留下底层斑马鱼组织；使用RNA提取试剂盒提取斑马鱼不同实验组的总RNA，利用超微量分光光度计测定RNA浓度，使用反转录试剂盒将RNA反转成cDNA，参照实时荧光定量PCR说明书，以各组反转完成后的cDNA为模板，加入待测引物在qRT
‑
PCR仪器中扩增，每组设置三个平行试验，检测各组提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b的表达水平；
[0019]④
提神醒脑药物的判断标准：
[0020]在沉睡时间下，与空白组相比，提神醒脑药物的游动总距离变大，游动速度增加，反应能力增强；提神醒脑药物和对照药咖啡因的提神醒脑标志基因表达变化相同，均为下调变化。
[0021]优选的，
①
确定待筛选药物和对照药咖啡因对斑马鱼幼鱼的最大安全浓度的具体步骤为：
[0022]将3日龄斑马鱼幼鱼随机分为空白组、对照药物组和若干实验组，每组鱼的数量相同，将斑马鱼幼鱼置于24孔细胞培养板中，每孔8～12条鱼，对24孔细胞培养板投放不同梯度浓度的待筛选药物浸泡3天，每个浓度测试重复3次，对斑马鱼的死亡率进行记录，通过SPSS软件计算确定实验组药物和对照组药物的最大安全浓度。
[0023]优选的，待筛选药物为远志提取物、酸枣仁提取物、杜仲雄花提取物、金盏菊提取物和车叶草苷。
[0024]一种提神醒脑药物车叶草苷，采用上述方法筛选出来。
[0025]本专利技术相比现有技术具有以下优点：
[0026]本专利技术的基于行为学指标和提神醒脑标志基因进行提神醒脑药物筛选的方法，首次采用用转录组学方法明确了nr1d4a和nr1d4b为提神醒脑的标志基因，在筛选过程中，首先通过行为学对各组斑马鱼进行初筛，然后对提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b设计上下游引物，进行RT
‑
qPCR验证，由于车叶草苷组和对照组的提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b的表达趋势一致，从而确定了待筛选药物车叶草苷具有提神醒脑作用。本专利技术的基于行为学指标和提神醒脑标志基因进行提神醒脑药物筛选的方法，操作流程短，易操作，筛选结果准确高效，将行为学表征和基因表达水平相结合，为以后提神醒脑药物的筛选提供了新的方法。
[0027]本专利技术的筛选方法，明确了待筛选药物车叶草苷的提神醒脑功效。
附图说明
[0028]图1为各组的斑马鱼幼鱼在光照刺激反应检测中游动的总距离示意图；(*P＜
0.05vs空白组，**P＜0.01vs空白组)；
[0029]图2为空白组的斑马鱼幼鱼在光照刺激反应检测中游动速度示意图；
[0030]图3为对照药物组(咖啡因组)的斑马鱼幼鱼在光照刺激反应检测中游动速度示意图；
[0031]图4为车叶草苷组的斑马鱼幼鱼在光照刺激反应检测中游动速度示意图；
[0032]图5为各组斑马鱼幼鱼提神醒脑标志性基因nr1d4a表达水平示意图(***P＜0.001vs空白组)；
[0033]图6为各组斑马鱼幼鱼提神醒脑标志性基因nr1d4b表达水平示意图(**P＜0.01vs空白组，***P＜0.001vs空白组)；
[0034]附图标记：
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.提神醒脑标志基因在筛选提神醒脑药物中的应用，其特征在于：所述提神醒脑标志基因为nr1d4a和nr1d4b。2.基于行为学指标和权利要求1所述的提神醒脑标志基因进行提神醒脑药物筛选的方法，其特征在于：包括以下步骤：
①
确定待筛选药物和对照药咖啡因对斑马鱼幼鱼的最大安全浓度；
②
基于光照刺激反应下的斑马鱼行为学表现，筛选提神醒脑药物：实验当晚24时，将5dpf的斑马鱼幼鱼转移至48孔板中，每孔一条鱼，将上述斑马鱼幼鱼分为对照药物组、空白组和若干实验组，其中对照药物组加入最大安全浓度的咖啡因，空白组加入1mL新鲜养鱼水，每个实验组加入1mL最大安全浓度的一种待筛选药物；每组均设置三个平行试验；将上述48孔板放入Zebrabox斑马鱼行为分析仪暗箱中，开始检测斑马鱼对光照刺激反应，检测时间为60分钟，每分钟记录一次数据，运用Zeblab软件进行数据处理，计算斑马鱼游动总距离和游动速度，测试不同组别斑马鱼在沉睡时间下的光照刺激反应；
③
基于Real
‑
time PCR技术，检测各组提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b的表达水平，筛选出提神醒脑药物：对提神醒脑标志基因nr1d4a和nr1d4b设计引物序列：nr1d4a
‑
RT
‑
F：AGATATCGCATCAGGGTTCC，nr1d4a
‑
RT
‑
R：CTCGTTCTTCACGCACATCT，nr1d4b
‑
RT
‑
F：ATCAGGTCATGCTGCTGAAG，nr1d4b
‑
RT<...

【专利技术属性】
技术研发人员：靳梦，张秀军，任擎宇，王利振，李宁，王荣春，孙晨，
申请(专利权)人：山东省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：