一种定性检测人类DNA中APOE基因的多态性的方法技术

本发明专利技术提供一种定性检测人类DNA中APOE基因的多态性的方法，涉及基因多态性检测技术领域。该定性检测人类DNA中APOE基因的多态性的方法，包括以下步骤：S1.前期准备，检测前，准备好相应的检测器械，然后再准备SDS

【技术实现步骤摘要】
一种定性检测人类DNA中APOE基因的多态性的方法


[0001]本专利技术涉及基因多态性检测
，具体为一种定性检测人类 DNA中APOE基因的多态性的方法。

技术介绍

[0002]APOE也叫载脂蛋白E是一种多态性蛋白，参与脂蛋白的转化与 代谢过程，其基因可以调节许多生物学功能，与许多眼科疾病发病有 关，对ApoE及其基因多态性的研究是医学研究的热点之一，探讨两 者之间的内在联系，对眼病的预防、诊断及治疗具有重要的临床应用 价值，载脂蛋白E主要存在于CM、VLDL、IDL和部分HDL中，正常人 血浆ApoE浓度为0.03～0.05g/L，ApoE的浓度与血浆甘油三酯含量 呈正相关。
[0003]多态性是广义的多态性指多种表现形式，“多态性”一词最早用 于生物学，指同在一个生物群体，各个体之间存在的形态学、生理学 和生化学的差异，并非所有多态性都是可以遗传的，生物群体中，同 基因组存在2个或2个以上等位基因的现象称为遗传多态性，遗传多 态性的形成机制是基因突变，遗传多态性类型很多，从个体的整体到 细胞、再到蛋白质、基因水平均存在着遗传多态性，包括：表型多态 性、染色体多态性、蛋白质多态性、酶多态性、抗原多态性及DNA多 态性，法医物证鉴定主要是通过对蛋白质多态性、酶多态性、抗原多 态性和DNA多态性的分析解决司法实践中的个人识别和亲权鉴定的 问题，现有方法中还没有对载脂蛋白E进行多态性检测的完整流程， 难以精确的检测载脂蛋白E多态性。

技术实现思路

[0004](一)解决的技术问题
>[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种定性检测人类DNA中 APOE基因的多态性的方法，解决了载脂蛋白E多态性检测不够完整， 数据不够精确的问题。
[0006](二)技术方案
[0007]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种定性 检测人类DNA中APOE基因的多态性的方法，包括以下步骤：
[0008]S1.前期准备
[0009]检测前，准备好相应的检测器械，然后再准备SDS
‑
PAGE试剂、 匀浆缓冲液、转膜缓冲液、0.01M PBS、膜染色液和显色液；
[0010]S2.样品获取
[0011]经过细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真 核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5
‑
1min，然后4℃， 13,000r离心15min，取上清液作为样品；
[0012]S3.进行电泳
[0013]制备电泳凝胶，进行SDS
‑
PAGE；
[0014]S4.半干式转移
[0015]电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min
×
3 次,然后进行膜处
理和转膜；
[0016]S5.四免疫反应
[0017]用0.01M PBS洗膜，5min
×
3次,加入包被液，平稳摇动，室温 2hr,弃包被液，用0.01M PBS洗膜，5min
×
3次,加入一抗,按合适稀 释比例用0.01M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部,4℃放置12hr以 上，阴性对照，以1％BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同,弃一抗 和1％BSA，用0.01M PBS分别洗膜，5min
×
4次,加入辣根过氧化物酶 偶联的二抗,按合适稀释比例用0.01M PBS稀释,平稳摇动，室温2hr, 弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min
×
4次,加入显色液，避光显色至 出现条带时放入双蒸水中终止反应。
[0018]优选的，所述S1中匀浆缓冲液具体的为1.0M Tris
‑
HCl，pH 6.8， 1.Oml，10％SDS 6.0ml，β
‑
巯基乙醇0.2ml，ddH2O 2.8ml。
[0019]优选的，所述S1中转膜缓冲液具体的为甘氨酸2.9g，Tris5.8g，SDS 0.37g，甲醇200ml，加ddH2O定容至1000ml。
[0020]优选的，所述S1中0.01M PBS具体的为NaCl 8.0g，KCl 0.2g， Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，加ddH2O至1000ml。
[0021]优选的，所述S1中膜染色液具体的为考马斯亮兰0.2g，甲醇 80ml，乙酸2ml，ddH2O118 ml，包被液，5％脱脂奶粉，现配，脱脂 奶粉1.0g溶于20ml的0.01M PBS中。
[0022]优选的，所述S1中显色液具体的为DAB 6.0mg，0.01M PBS 10.0ml， 硫酸镍胺0.1ml，H202 1.0μl。
[0023]优选的，所述S4中膜处理具体的为预先裁好与胶条同样大小的 滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。
[0024]优选的，所述S4中转膜具体的为转膜装置从下至上依次按阳极 碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好， 滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将 碳板上多余的液体吸干，接通电源，恒流1mA/cm2，转移1.5hr，转 移结束后，断开电源将膜取出，割取待测膜条做免疫印迹，将有蛋白 标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50％甲醇中多次脱色， 至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色 结果作对比。
[0025](三)有益效果
[0026]本专利技术提供了一种定性检测人类DNA中APOE基因的多态性的方 法。具备以下有益效果：
[0027]本专利技术提供了一种定性检测人类DNA中APOE基因的多态性的方 法，该方法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探 针”是抗体，“显色”用标记的二抗，经过PAGE分离的蛋白质样品， 转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持 电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变，以固相载体上的蛋白质或 多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第 二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性 目的基因表达的蛋白成分，这样即可实现对载脂蛋白E多态性的检 测，操作简单，检测方便，数据更加全面和准确。
具体实施方式
[0028]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描
述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部 的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性 劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0029]实施例：
[0030]本专利技术实施例提供一种定性检测人类DNA中APOE基因的多态性 的方法，包括以下步骤：
[0031]S1.前期准备
[0032]检测前，准备好相应的检测器械，然后再准备SDS
‑
PAGE试剂、 匀浆缓冲液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种定性检测人类DNA中APOE基因的多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.前期准备检测前，准备好相应的检测器械，然后再准备SDS
‑
PAGE试剂、匀浆缓冲液、转膜缓冲液、0.01M PBS、膜染色液和显色液；S2.样品获取经过细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5
‑
1min，然后4℃，13,000r离心15min，取上清液作为样品；S3.进行电泳制备电泳凝胶，进行SDS
‑
PAGE；S4.半干式转移电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min
×
3次,然后进行膜处理和转膜；S5.四免疫反应用0.01M PBS洗膜，5min
×
3次,加入包被液，平稳摇动，室温2hr,弃包被液，用0.01M PBS洗膜，5min
×
3次,加入一抗,按合适稀释比例用0.01M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部,4℃放置12hr以上，阴性对照，以1％BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同,弃一抗和1％BSA，用0.01M PBS分别洗膜，5min
×
4次,加入辣根过氧化物酶偶联的二抗,按合适稀释比例用0.01M PBS稀释,平稳摇动，室温2hr,弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min
×
4次,加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。2.根据权利要求1所述的一种定性检测人类DNA中APOE基因的多态性的方法，其特征在于：所述S1中匀浆缓冲液具体的为1.0MTris
‑
HCl，pH 6.8，1.Oml，10％SDS 6.0ml，β
‑
巯基乙醇0.2ml，ddH2O 2.8ml。3.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽，曹思，杨晓彤，陈大志，
申请(专利权)人：黑龙江省诺亚方舟基因技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：