一种两亲性双位点受体的合成及其荧光指示剂置换法识别ATP与生物硫醇制造技术

本发明专利技术公开了一种两亲性双位点受体的合成及其荧光指示剂置换法识别ATP与生物硫醇。该双位点受体含有ATP识别基团联吡啶盐正离子及生物硫醇作用位点二硫键。受体分子与荧光指示剂在水溶液中能自组装成纳米组装体，且发生指示剂荧光猝灭。加入ATP和生物硫醇后纳米组装体发生荧光恢复，对ATP检测限达到7.14nM，生物硫醇以谷胱甘肽为例，检测限也能达到9.83nM。该纳米聚集体有较低细胞毒性和高细胞通透性，适用于活细胞中ATP和GSH水平的成像。适用于活细胞中ATP和GSH水平的成像。适用于活细胞中ATP和GSH水平的成像。

【技术实现步骤摘要】
一种两亲性双位点受体的合成及其荧光指示剂置换法识别ATP与生物硫醇


[0001]本专利技术属于化学合成与生物应用领域，具体涉及一种双位点自组装材料的合成，及利用指示剂置换法在检测ATP和生物硫醇中的应用。

技术介绍

[0002]三磷酸腺苷作为“细胞的能量货币”，在细胞分裂、细胞内信号转导、细胞膜转运、蛋白质合成等功能中发挥着重要作用。人体细胞中ATP/AMP和ATP/ADP的比值与ATP稳态密切相关。并且细胞内ATP水平的异常已被证明与多种疾病密切相关，包括癌症和帕金森病。
[0003]生物硫醇主要包括半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)，这些硫醇与生物系统中的代谢和运输重要的酶和蛋白质有关。这些硫醇的内源性浓度表明了相应的酶和蛋白质的功能状态，并且它们的异常水平与疾病相关。例如，半胱氨酸水平的异常与肝损伤、皮肤损伤和生长迟缓等有关。GSH是细胞内最丰富的非蛋白硫醇。游离GSH及其氧化态谷胱甘肽二硫醚(通常为>100：1)的比例是反映相应酶活性和细胞氧化还原状态的指标。GSH的异常水平也是许多疾病的信号，如艾滋病、癌症、肝和肺损伤和帕金森病。因此，对ATP和生物硫醇等多分析物的同时检测具有重要意义。
[0004]近年来，自组装纳米结构材料以其高灵敏度和优异的生物相容性等优点而受到广泛关注。多位点材料的设计因其能够同时检测和可视化活细胞中的两种或多种分析物从而提高诊断的全面性和准确性已逐渐成为研究热点。已经报道的有关ATP和生物硫醇的自组装纳米结构材料多是单一检测的，那么将双位点引入自组装纳米材料以实现同时区分检测ATP和生物硫醇的目的是很有必要的。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的不足与难题，本专利技术的目的在于提供一种两亲性双位点受体的合成及其荧光指示剂置换法识别ATP与生物硫醇。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0007]本专利技术提供了一种用于荧光指示剂置换法识别ATP和生物硫醇双位点两亲性双位点受体，缩写为Bp
‑
SS
‑
C13，其结构如下：
[0008][0009]本专利技术还提供了上述的识别ATP和生物硫醇双位点两亲性双位点受体的制备方法，包括以下步骤：
[0010][0011](1)中间化合物1的合成：胱胺盐酸盐和三乙胺溶于甲醇中，冰浴条件下缓慢滴加二碳酸二叔丁酯，反应结束后，真空除去溶剂得到固体，并用乙醚洗涤，真空干燥得到白色固体化合物1；
[0012](2)中间化合物2的合成：将化合物1和十四酸溶解在二氯甲烷中，加入二环己基碳二亚胺和4
‑
二甲氨基吡啶，在常温条件下进行反应，反应结束后分离提纯得到白色固体化合物2；
[0013](3)中间化合物3的合成：将化合物2溶在二氯甲烷中，加入三氟乙酸，常温反应三个小时，加入甲苯真空除去溶剂得到淡黄色液体，冷冻得到淡黄色固体化合物3；
[0014](4)中间化合物4的合成：将化合物3溶在二氯甲烷中，冰浴条件下缓慢滴加溴乙酰溴，反应结束后，经分离提纯得到白色固体化合物4；
[0015](5)化合物Bp
‑
SS
‑
C13的合成：将化合物4，碘化钾和4，4
‑
联吡啶溶解在乙腈中，在氮气氛围下加热回流，反应完全后冷却至室温，经分离提纯得到黄色固体化合物Bp
‑
SS
‑
C13。
[0016]优选地，步骤(4)所述的化合物3和溴乙酰溴的摩尔比为1：2
‑
2.3，反应时间三个小时。步骤(5)所述的4，4
‑
联吡啶和化合物4的摩尔比为1：2
‑
2.5，反应时间72小时。
[0017]本专利技术还提供了一种识别ATP和生物硫醇双位点自组装纳米材料，是上述的Bp
‑
SS
‑
C13与荧光指示剂在水溶液中自组装成纳米聚集体，纳米聚集体不发光。
[0018]优选地，荧光指示剂包括荧光素钠(UD)、署红(EY)、溶剂绿7(HPTS)、玫瑰红和4,4',4”,4”'
‑
(卟啉
‑
5,10,15,20
‑
四基)四苯磺酸中的一种或几种。
[0019]本专利技术的双位点自组装纳米材料检测ATP和生物硫醇的测试条件：无特殊说明，选取荧光素钠(UD)为指示剂，生物硫醇以谷胱甘肽为例，在HEPES缓冲溶液(10mMpH＝7.4)中进行测试。
[0020]本专利技术的双位点自组装纳米材料的作用机理，包含两部分：一是识别ATP的特征在于联吡啶盐和ATP的磷酸部分的静电引力、氢键、Л
‑
Л作用更强，可以将指示剂置换出来；二是识别生物硫醇的特征在于其巯基可以有效的剪断探针的硫硫键，打破组装。当ATP存在时,可以有效置换出荧光素钠(UD)，荧光明显增强。当生物硫醇存在时,可以有效的剪断探针的硫硫键，指示剂释放出来荧光增强。
[0021]本专利技术的双位点自组装纳米材料的选择性好。含有联吡啶盐猝灭基团可以有效猝
灭阴离子指示剂荧光素钠(UD)的荧光，加入ATP、生物硫醇后荧光恢复。
[0022]本专利技术的双位点自组装纳米材料与UD络合时，加入10eq的ATP和生物硫醇，在515nm处的荧光明显增强，而加入其他阴离子(ADP，PPi，COO
‑
，NO3‑
，Cl
‑
，Pi，Br
‑
，SO
42
‑
，CO
32
‑
，AMP，F
‑
，I
‑
)和氨基酸(Glu，Arg，His，Met，Thr，Ser，Ala，Asp，Leu，Gly，PHe，Tyr，Val，Trp，Lys)荧光没有明显增强。
[0023]本专利技术的双位点自组装纳米材料抗干扰能力较强，在其他分析物(ADP，PPi，COO
‑
，NO3‑
，Cl
‑
，Pi，Br
‑
，SO
42
‑
，CO
32
‑
，AMP，F
‑
，I
‑
，Glu，Arg，His，Met，Thr，Ser，Ala，Asp，Leu，Gly，PHe，Tyr，Val，Trp，Lys)的存在下几乎不影响检测ATP和生物硫醇的效果。
[0024]本专利技术的双位点自组装纳米材料对ATP和生物硫醇具有较低的检测限，低达10
‑
11
。
[0025]本专利技术的双位点自组装纳米材料对生物硫醇的响应时间较短，在四十分钟左右就可以达到平衡。
[0026]本专利技术的双位点自组装纳米材料pH应用范围较宽，7
‑
10均可检测。
[0027]本专利技术的双位点自组装纳米材料通过荧光共聚焦显微镜成像技本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于荧光指示剂置换法识别ATP和生物硫醇双位点两亲性双位点受体，其特征在于，缩写为Bp
‑
SS
‑
C13，其结构如下：2.一种如权利要求1所述的识别ATP和生物硫醇双位点两亲性双位点受体的制备方法，其特征在于，将4，4
‑
联吡啶和化合物4溶于溶剂中，在催化剂的催化作用下通过成盐得到目标物。3.根据权利要求2所述的识别ATP和生物硫醇双位点两亲性双位点受体的制备方法，其特征在于，所述溶剂为超干乙腈，催化剂为碘化钾，4，4
‑
联吡啶和化合物4的摩尔比为1：2～2.5。4.根据权利要求2所述的识别ATP和生物硫醇双位点两亲性双位点受体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)中间化合物1的合成：胱胺盐酸盐和三乙胺溶于甲醇中，冰浴条件下缓慢滴加二碳酸二叔丁酯，反应结束后，真空除去溶剂得到固体，并用乙醚洗涤，真空干燥得到白色固体化合物1；(2)中间化合物2的合成：将化合物1和十四酸溶解在二氯甲烷中，加入二环己基碳二亚胺和4
‑
二甲氨基吡啶，在常温条件下进行反应，反应结束后分离提纯得到白色固体化合物2；(3)中间化合物3的合成：将化合物2溶在二氯甲烷中，加入三氟乙酸，常温反应三个小时，加入甲苯真空除去溶剂得到淡黄色液体，冷冻得到淡黄色固体化合物3；(4)中间化合物4的合成：将化合物3溶在二氯甲烷中，冰浴条件下缓慢滴加溴乙酰溴，反应结束后，经分离提纯得到白色固体化合物4；
(5)化合物Bp
‑
SS
‑
C13的合成：将化合物4，碘化钾和4，4
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【专利技术属性】
技术研发人员：曹迁永，秦佳美，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：