体外快速高效分化获得人多能干细胞来源的NK细胞的方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种体外快速高效分化获得人多能干细胞来源的自然杀伤细胞(NK细胞)的培养基及其用途和制备NK细胞的方法。培养基包括：基础培养基、维生素C、IGF

【技术实现步骤摘要】
体外快速高效分化获得人多能干细胞来源的NK细胞的方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物领域，具体地，本专利技术涉及一种体外快速高效分化获得人多能干细胞来源的NK细胞的方法及应用，更具体地，本专利技术涉及一种培养基及其用途和制备NK细胞的方法。

技术介绍

[0002]免疫细胞疗法在肿瘤治疗中具有重要意义。自然杀伤细胞(Nature killer cells，NK)作为健康人体内清除癌变细胞的主要细胞，具有显著的抗癌效果，对急性淋系白血病等血液瘤和肝癌等实体瘤具有重要意义。
[0003]目前较为成熟的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR
‑
T)治疗具有严重的副反应，例如神经毒性和“细胞因子风暴”(cytokine release syndrome，CRS)，患者病情凶险，预后差。与T细胞相比，NK细胞具有更高的安全性，目前临床试验尚未报道过继NK细胞治疗产生如移植物抗宿主疾病(graft
‑
versus
‑
host disease，GvHD)和CRS 等严重副作用。同时，NK细胞发挥功能无MHC限制性决定了未来NK的应用范围比T细胞的应用范围更为广泛。目前临床试验采用从健康人外周血单个核细胞分离并扩增的NK 细胞，存在供体来源不足、一个捐献者提供的NK细胞只能治疗一位病人等问题，且存在个体间差异，难以做到规模化和标准化，对于评估患者预后存在较大困难。以上问题对提供剂量足够且有抗肿瘤活性的NK细胞提出新的要求。
[0004]目前，通过诱导人诱导性多能干细胞(hiPSC)向造血干/祖细胞(HSPCs)分化，得到大量CD34+CD43+HSPCs，HSPCs具有淋系和髓系分化潜能；随后诱导HSPCs向NK细胞分化，得到功能成熟的NK细胞(iPS
‑
NK)；再扩增NK细胞到临床应用规模。
[0005]因此，亟需开发一种新的获得NK细胞的方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本专利技术提供了一种培养基及其用途和制备NK细胞的方法，本专利技术的培养能够使造血干/祖细胞分化产生NK细胞，且该培养基可有效促进造血干/祖细胞分化成NK细胞，具有培养周期短和得到的NK细胞纯度高等优点。
[0007]本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：
[0008]目前，使造血干/祖细胞分化产生NK细胞的培养方法中，可能需要根据造血干/祖细胞的分化状态更换培养基，操作繁琐；并且，传统的培养方法中，将造血干/祖细胞体外分化形成NK细胞的时间一般为14～30天，培养周期长。
[0009]为了解决上述问题，专利技术人经过大量实验对培养基的组分和添加量进行调整，最终发现，在培养基中同时加入维生素C和IGF
‑
1，可有效促进造血干/祖细胞分化为NK细胞，该培养过程仅需8～10天，且得到的NK细胞纯度为90％以上，具有NK细胞纯度高、培养周期
短等优点。
[0010]基于此，在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种培养基。根据本专利技术的实施例，所述培养基包括：基础培养基、维生素C、IGF
‑
1、血清、谷氨酰胺、双抗、IL2、IL7、IL15、 SCF和Flt3
‑
L。专利技术人经过大量实验得到上述较优培养基，该培养基可促进造血干/祖细胞分化为NK细胞，具有NK细胞纯度高、培养周期短等优点。
[0011]在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了一种前述培养基在促进造血干/祖细胞分化为NK 细胞中的用途。专利技术人经过实验发现，采用前述培养基，可促进造血干/祖细胞分化为NK 细胞，具有NK细胞纯度高、培养周期短等优点。
[0012]在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种制备NK细胞的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：利用前述的培养基培养造血干/祖细胞，以便获得所述NK细胞。根据本专利技术实施例的制备NK细胞的方法可促进造血干/祖细胞分化为NK细胞，具有NK细胞纯度高、培养周期短等优点。
[0013]在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种培养基。根据本专利技术的实施例，所述培养基包括：HDM培养基、BMP信号通路激活剂、Activin A、bFGF和GSK3抑制剂。专利技术人经过大量实验得到上述较优培养基，该培养基可促进多能干细胞分化为早期中胚层细胞。
[0014]在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种培养基。根据本专利技术的实施例，所述培养基包括：HDM培养基、BMP信号通路激活剂、TGF
‑
β通路抑制剂和WNT通路抑制剂。专利技术人经过大量实验得到上述较优培养基，该培养基可促进早期中胚层细胞分化为侧板中胚层细胞(lateral mesoderm，简称LM)。
[0015]在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种培养基。根据本专利技术的实施例，该培养基包括：HDM培养基、VEGF、bFGF、TGF
‑
β受体阻断剂、促血小板生成素、IL
‑
6、SCF和IL
‑
3。专利技术人经过大量实验得到上述较优培养基，该培养基可促进生血内皮细胞分化为造血干/祖细胞。
[0016]本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
附图说明
[0017]本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0018]图1是根据本专利技术一个实施例中从造血干细胞到NK细胞培养过程的示意图；
[0019]图2是根据本专利技术实施例1中培养过程的第2、4、6、8天的细胞形态图；
[0020]图3是根据本专利技术实施例1中的早期中胚层细胞、侧板中胚层细胞及生血内皮细胞的分化效率检测结果；
[0021]图4是根据本专利技术实施例1中分化第8天生成NK细胞的检测结果；
[0022]图5是根据本专利技术实施例2中获得的NK细胞生成CD45和CD56的情况以及其与外周血中的NK形态对比；
[0023]图6是根据本专利技术实施例2中获得的NK细胞CD45、CD56、CD16、CD94、NKG2D 和NKP46的表达；
[0024]图7是根据本专利技术实施例3中检测K562刺激或PMA刺激后的NK细胞分泌INF
‑
γ的情况；
[0025]图8是根据本专利技术实施例4中检测NK细胞杀伤肿瘤细胞的情况；
[0026]图9是根据本专利技术实施例4中检测NK细胞在不同效靶比情况下对不同肿瘤细胞的杀伤能力；
[0027]图10是根据本专利技术实施例5中不同组中分化第10天生成NK细胞的检测结果。
具体实施方式
[0028]下面详细描述本专利技术的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。
[0029]需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种培养基，其特征在于，包括：基础培养基、维生素C、IGF
‑
1、血清、谷氨酰胺、双抗、IL2、IL7、IL15、SCF和Flt3
‑
L。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基选自α
‑
MEM培养基；任选地，所述双抗为青霉素和链霉素；任选地，所述维生素C在所述培养基中的终浓度为0.1
‑
100mg/ml；任选地，所述IL2在所述培养基中的终浓度为0.1
‑
100ng/ml；任选地，所述IL7在所述培养基中的终浓度为0.1
‑
100ng/ml；任选地，所述IL15在所述培养基中的终浓度为0.1
‑
100ng/ml；任选地，所述SCF在所述培养基中的终浓度为0.1
‑
100ng/ml；任选地，所述Flt3
‑
L在所述培养基中的终浓度为0.1
‑
100ng/ml；任选地，所述血清在所述培养基中的终浓度为5
‑
25％；任选地，所述谷氨酰胺在所述培养基中的终浓度为0.5
‑
1.5％；任选地，所述双抗是以溶液的形式提供的；任选地，所述双抗在所述培养基的终浓度为0.5
‑
1.5％。3.权利要求1或2所述的培养基在促进造血干/祖细胞分化为NK细胞中的用途。4.一种制备NK细胞的方法，其特征在于，包括：利用权利要求1或2所述的培养基培养造血干/祖细胞，以便获得所述NK细胞。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，进一步包括：在培养所述造血干/祖细胞之前，预先于所述培养基中加入小鼠骨髓基质细胞；任选地，所述培养的时间为8～10天；任选地，所述造血干/祖细胞是将多能干细胞进行分化培养获得的；优选地，所述造血干/祖细胞是将多能干细胞在多能干细胞分化培养基中进行分化培养处理获得的；任选地，所述多能干细胞分化培养基包括第一分化培养基、第二分化培养基、第三分化培养基和第四分化培养基；任选地，所述分化培养处理包括：将所述多能干细胞在所述第一分化培养基中进行第一培养处理；将所述第一培养处理的产物在所述第二分化培养基中进行第二培养处理；将所述第二培养处理的产物在所述第三分化培养基中进行第三培养处理；将所述第三培养处理的产物在所述第四分化培养基中进行第四培养处理，以便获得所述造血干/祖细胞。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一分化培养基包括：HDM培养基、BMP信号通路激活剂、Activin A、bFGF和GSK3抑制剂；任选地，所述BMP信号通路激活剂在所述第一分化培养基中的终浓度为0.1
‑
100mg/ml；任选地，所述Activin A在所述第一分化培养基中的终浓度为0.1
‑
100ng/ml；任选地，所述bFGF在所述第一分化培养基中的终浓度为0.1
‑
100ng/ml；任选地，所述GSK3抑制剂在所述第一分化培养基中的终浓度为0.1
‑
100μM；任选地，所述BMP信号通路激活剂选自BMP4；任选地，所述GSK3抑制剂选自CHIR99021；
任选地，所述第一培养处理的时间为22
‑
24h；任选地，所述第二分化培养基包括：HDM培养基、BMP信号通路激活剂、TGF
‑
β通路抑制剂和WNT通路抑制剂；任选地，所述BMP信号通路激活剂在所述第二分化培养基中的终浓度为0.1
‑
100ng/ml；任选地，所述A8
‑
301在所述第二分化培养基中的终浓度为0.1
‑
10μM；任选地，所述WNT通路抑制剂在所述第二分化培养基中的终浓度为0.1
‑
10μM；任选地，所述BMP信号通路激活剂选自BMP4；任选地，TGF
‑
β通路抑制剂选自A
‑
83
‑
01；任选地，所述WNT通路抑制剂选自IWR
‑1‑
endo；任选地，所述第二培养处理的时间为22
‑
24h；任选地，所述第三分化培养基包括：HDM培养基、VEGF和bFGF；任选地，所述VEGF在所述第三分化培养基中的终浓度为0.1
‑
100ng/ml；任选地，所述bFGF在所述第三分化培养基中的终浓度为0.1
‑
100ng/ml；任选地，所述第三培养处理的时间为45
‑
48h；任选地，所述第四分化培养基包括：HDM培养基、VEGF、bFGF、TGF
‑
β受体阻断剂、促血小板生成素、IL
‑
6、SCF和IL
‑
3；任选地，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘光锦，朱艳玲，唐俊，麦玉婵，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：