NK细胞的扩增载体及其在在扩增培养NK细胞中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种NK细胞的扩增载体，可以安全高效的扩增NK细胞，进一步通过与特异性人工脂质体的融合，可以获得特异性复合脂质体，以实现靶向病毒或肿瘤的特异性NK细胞的高效安全扩增。本发明专利技术通过在脂质体扩增上添加特异性肿瘤抗原，可制备的肿瘤靶向性NK细胞，具有肿瘤杀伤率高，安全有效等优势；作为新型免疫细胞治疗方案，可通过与常规治疗方案联合使用增强抗肿瘤或病毒治疗效果。增强抗肿瘤或病毒治疗效果。增强抗肿瘤或病毒治疗效果。

【技术实现步骤摘要】
NK细胞的扩增载体及其在在扩增培养NK细胞中的应用


[0001]本专利技术涉及NK细胞的扩增载体及其在在扩增培养NK细胞中的应用。

技术介绍

[0002]NK细胞，又称为自然杀伤细胞，作为免疫系统的重要组成部分，是人体内抵御病毒、细菌等外源微生物感染，清除衰老、病变及癌变细胞，参与免疫调节，维护机体稳态的天然免疫屏障。人体内的NK细胞为CD3
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CD56
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淋巴细胞群占外周血淋巴细胞总数10％～15％，以杀伤功能为主的CD56
dim
CD16
+
亚群，是外周血中最主要的NK细胞。NK细胞表面表达多种抑制型和活化型受体，通过抑制与活化信号平衡，维持对宿主正常组织细胞的耐受和对异常细胞的杀伤。NK细胞识别病毒感染细胞后，可以通过快速释放穿孔素和颗粒酶或发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，直接或间接杀死病毒感染细胞。此外，NK细胞能够分泌促炎细胞因子IFN
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γ、IFN
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α/β、TNF
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α，激活更广泛的免疫应答来控制病毒感染。研究发现，NK细胞具有免疫记忆功能，能够分化为抗原特异性的记忆NK细胞在再次受到病毒抗原刺激时，能发挥更强大的抗病毒能力。
[0003]NK细胞的活化受到细胞表面表达的激活受体和抑制受体的调控，这些受体可以识别来自于邻近正常细胞或癌变细胞所释放的配体。当来自NK细胞表面受体的激活信号强于抑制信号时，NK细胞就被激活；当来自NK细胞表面受体的激活信号弱于抑制信号时，NK细胞就被沉默。目前已发现多种激活受体和抑制受体，激活受体主要有NKG2D、NKp30、NKp44和NKp46；抑制受体主要有KIR2DL1、KIR2DL3和NKG2A。
[0004]NK细胞的体外活化和大规模扩增是满足NK细胞临床应用的关键所在。目前，NK细胞的扩增主要依赖K562滋养细胞的刺激。K562滋养细胞异源表达的跨膜IL
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21能促进NK细胞扩增2000倍以上，同时特异性的激活STAT3信号通路，保持扩增后NK细胞端粒酶的活性和端粒的长度。扩增后的NK细胞高水平表达NKG2D、NKp30、NKp44和NKp46等激活受体，细胞杀伤功能显著增强。NK细胞体外扩增培养体系的建立，实现了大规模NK细胞的扩增和获取，为肿瘤病人的临床治疗带来了希望。经体外扩增的NK细胞高水平表达激活受体和杀伤效应蛋白，在体内和体外的抗肿瘤测试中展现出更强的肿瘤细胞杀伤能力。虽然滋养细胞扩增NK细胞的效率非常高，其仍存在无法避免的诸多问题，如K562滋养细胞为肿瘤细胞，其在细胞制品中的残留将严重危害患者的健康；K562细胞的代谢物可能具有免疫抑制潜力，可能会影响NK细胞的活性。因此，开发替代K562滋养细胞的NK细胞体外扩增系统具有非常重要的临床意义和工业应用价值。
[0005]人工脂质体是一类由固态天然或合成的卵磷脂、甘油三酯等组成的亚微粒脂质单分子层结构系统。通过将药物包裹于纳米脂质体中构建药物递送系统系统，具有延长疗效、减少给药剂量、降低不良反应、改变给药途径、毒性低、生物相容性好、生物可降解等优点。同时，纳米脂质体可以在表面修饰相关的配体，使脂质体通过受体介导的方式进入细胞，从而有效提高靶器官的药物浓度，提高相应的生物利用度，减少毒副作用的发生。众所周知，经配体修饰的脂质体能够实现伪装或主动靶向，将药物定向地运送到靶器官而发挥药效。
例如，经表面修饰后的脂质体可逃避巨噬细胞识别，或因修饰有特定的配体可与靶细胞的受体相结合，改变脂质体在体内的组织分布而到达特定的靶器官。然而，目前利用脂质体技术用于NK免疫细胞的体外激活和大规模扩增仍有待于研究。通过在人工脂质体表面挂载不同因子的蛋白片段已用于NK细胞的体外扩增，这一扩增方法的扩增效率仍弱于经典的K562滋养细胞扩增体系。因此，高效的NK细胞体外扩增系统仍有待于开发。
[0006]近2年来，新型冠状病毒的突然出现严重冲击世界各国的医疗卫生系统。截止目前，全球新冠病毒感染者已多达2.4亿人，死亡人数已达480万人病毒是一种个体微小，结构简单，只含一种核酸(DNA或RNA)，必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物。病毒依赖宿主细胞而存活，其感染复制周期大致包括：吸附、穿入、脱壳、生物合成(病毒核酸复制；病毒蛋白质合成)、装配与释放。根据病毒核酸类型的不同，动物病毒可以分为三大类：DNA病毒、DNA和RNA逆转录病毒、RNA病毒。其中，DNA病毒包括腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、肝炎病毒等，DNA和RNA逆转录病毒包括肉瘤病毒和艾滋病毒等，RNA病毒包括SARS冠状病毒、埃博拉病毒、流感病毒等。新冠病毒的治疗仍存在以下难点:病毒藏在细胞内，目前缺乏抗病毒特效药；病毒感染患者存在严重的免疫系统失调。目前针对病毒性传染病的防治主要以抗病毒抑制剂及特异性疫苗的研制与应用为主。然而，大多数病毒性疾病至今尚无特效抑制剂，而能够应用疫苗进行防治的病毒性疾病也很少。SARS
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CoV
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2作为全新发现的单股正链RNA病毒，依赖宿主细胞进行新病毒的合成。虽然目前COVID
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19病毒的疫苗接种已经覆盖大部分国人，境外输入的病毒传播仍时有发生。针对COVID
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19病毒的防控生物制剂仍有待开发。目前抗RNA病毒都是基于病毒复制过程依赖宿主细胞的RNA聚合酶等机理而研发特异性的RNA聚合酶抑制剂(小分子化合物，瑞德西韦)，而此类抑制剂的研发周期长、失败率高，使得开发针对逆转录酶的特异性抑制剂难度很大，此外，COVID
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19病毒的RNA可以直接指导蛋白质合成，RNA聚合酶抑制剂对此根本无效。NK细胞具备天然的病毒识别和清除能力，已有研究表明，其在甲型流感病毒、乙肝病毒、艾滋病毒、丙肝病毒等多种病毒感染中也发挥重要作用。靶向病毒衣壳蛋白的NK细胞可以特异性的吞噬清除游离病毒，或杀伤病毒感染的宿主细胞，为治疗COVID
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19病毒感染患者提供了潜在的靶点和途径。因此，研发和大规模制备病毒靶向性NK细胞应用于肆虐全球的新冠病毒治疗具有非常重要的临床意义和社会价值。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供NK细胞的扩增载体；这种扩增载体不仅具有高效的扩增效率，且有效规避了K562滋养细胞扩增体系中产生的残留和代谢物带来的副作用。
[0008]本专利技术采用如下技术方案：NK细胞的扩增载体，包括：从K562滋养细胞中提取的细胞膜成分。
[0009]进一步地，所述细胞膜成分为K562滋养细胞膜脂质体(mb
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IL21脂质体)。
[0010]进一步地，还包括嵌合有肿瘤或病毒特异性抗原蛋白的人工脂质体。通过大量实验证明，脂质体扩增载体可以很好的实现NK细胞的体外激活和扩增，病毒靶向性NK细胞具有识别和杀伤病毒感染细胞的能力，从而快速和高效的降低细胞内病毒拷贝数，肿瘤靶向性NK细胞具有识别和杀伤肿瘤细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.NK细胞的扩增载体，其特征在于，包括：从K562滋养细胞中提取的细胞膜成分。2.根据权利要求1所述的扩增载体，其特征在于，所述细胞膜成分为K562滋养细胞膜脂质体(mb
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IL21脂质体)。3.根据权利要求1所述的扩增载体，其特征在于，还包括嵌合有肿瘤或病毒特异性抗原蛋白的人工脂质体。4.根据权利要求3所述的扩增载体，其特征在于，所述mb
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IL21脂质体与所述人工脂质体融合。5.根据权利要求3所述扩增载体，其特征在于，所述嵌合有肿瘤或病毒特异性抗原蛋白的人工脂质体，为：嵌合病毒衣壳蛋白的纳米脂质体，或为嵌合肿瘤特异性抗原的纳米脂质体；所述病毒为甲型肝炎病毒(NC_001489.1)、乙型肝炎病毒(NC_003977.2)、丙型肝炎病毒(NC_004102.1)、1型艾滋病毒(NC_001802.1)、2型艾滋病毒(NC_001722.1)、人乳头瘤病毒6型(HG793939.1)、人乳头瘤病毒11型(FR872717.1)、人乳头瘤病毒16型(NC_001526.4)、人乳头瘤病毒18型(NC_001357.1)、人乳头瘤病毒31型(J04353.1)、人乳头瘤病毒33型(M12732.1)、人乳头瘤病毒45型(KC470260.1)、人乳头瘤病毒52型(LC373207.1)、人乳头瘤病毒58型(FJ385268.1)、麻疹病毒(NC_001498.1)、狂犬病毒(NC_001542.1)、SARS冠状病毒(NC_004718.3)、埃博拉病毒(NC_006432.1)、新冠病毒COVID
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19(MN908947.3)；所述肿瘤的类型包括但不限于：急性淋巴细胞白血病，急性髓系白血病，肾上腺皮质癌，艾滋病相关的癌症，肛门癌，星形细胞瘤，非典型畸胎/横纹肌样瘤，中枢神经系统瘤，基底细胞癌
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皮肤癌(非黑色素瘤)，胆管癌，膀胱癌，骨肿瘤，骨肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤，脑干胶质瘤，脑肿瘤，乳腺癌，支气管肿瘤，中枢神经系统肿瘤，子宫颈癌，脊索瘤，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，慢性粒细胞性白血病(CML)，慢性骨髓增生性疾病，结肠癌，大肠癌，颅咽管瘤，皮肤T细胞淋巴瘤
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蕈样肉芽肿，乳腺导管原位癌，胚胎性肿瘤，中枢神经系统瘤，子宫内膜癌，室管膜瘤，食管癌，嗅神经母细胞，尤因肉瘤家族肿瘤，颅外生殖细胞瘤，性腺外生殖细胞肿瘤，肝外...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱荣华，
申请(专利权)人：广州蒽恺赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：