人工酶检测肿瘤细胞的传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器及其制备方法和应用。该传感器包括捕获电极、循环肿瘤细胞、信号放大器和底物；捕获电极为负载有捕获抗体的电极；信号放大器为人工酶

【技术实现步骤摘要】
人工酶检测肿瘤细胞的传感器及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]循环肿瘤细胞作为肿瘤转移的细胞起源，是判断癌症发病进程及预后评价的重要生物标志物。循环肿瘤细胞的检测可有效地应用于体外早期诊断、化疗药物的快速评估、肿瘤复发的监测以及肿瘤新药物的开发等。但其在患者血液中含量极低，大约每100万个血细胞中才有1个肿瘤细胞，捕获难度高。因此，发展简便易行、特异性高、灵敏度高的循环肿瘤细胞检测方法，是目前亟需解决的技术难题。
[0003]光电化学生物传感器是近年来新兴的一种生物传感技术，具有灵敏度高、背景信号低、操作简单等诸多优点，广泛地应用于DNA检测、免疫分析等。为提高光电化学生物传感器的灵敏度，许多信号放大技术应运而生。其中，人工酶是具有纳米材料特性和天然酶催化活性的酶模拟物。与天然酶相比，纳米材料具有多种优点，如存储周期长、成本低、稳定性高以及易于表面改性。因此，开发一种高性能的人工酶检测肿瘤细胞传感器是一项非常有价值的研究工作。

技术实现思路

[0004]为了实现简便易行、高特异性、高灵敏度的循环肿瘤细胞检测，本专利技术提供一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器及其制备方法和应用。
[0005]具体地，本专利技术提供的一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器，包括捕获电极、循环肿瘤细胞、信号放大器和底物；
[0006]所述捕获电极为负载有捕获抗体的电极；
[0007]所述信号放大器为人工酶
‑
检测抗体共轭物；
[0008]所述人工酶阻碍电子供体到达电极表面且催化底物得到沉淀物，所述沉淀物为电子受体且沉积在电极表面，所述检测抗体和捕获抗体均为循环肿瘤细胞表面抗原的特异性抗体。
[0009]上述传感器中，所述捕获电极为封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极，具体是在氧化铟锡电极表面依次负载二氧化钛、壳聚糖、捕获抗体，然后采用封闭剂封闭后得到的。其中，所述氧化铟锡电极可以更换为其它电极，二氧化钛的作用是作为半导体材料，产生传感器的初始光电流信号；所述封闭剂的作用是为了占据所述二氧化钛纳米颗粒上的活性位点，封闭剂具体可以采用牛血清白蛋白。
[0010]上述传感器中，所述人工酶为Co3O4@MnO2@CDs多面体，该人工酶是在Co3O4多面体上依次生长MnO2和CDs制备得到的，所述Co3O4多面体由ZIF
‑
67分解氧化而成。
[0011]上述传感器中，所述底物为过氧化氢和4
‑
氯
‑1‑
奈酚，所述沉淀物为4
‑
氯
‑1‑
奈醌。
[0012]上述传感器中，所述循环肿瘤细胞为A549细胞。当循环肿瘤细胞为A549细胞时，捕
获抗体和检测抗体为A549细胞表面上的抗原上皮细胞粘附分子(EpCAM)的特异性抗体。当选择A549细胞外的其他目标循环肿瘤细胞时，可更换对应的捕获抗体和检测抗体。
[0013]上述人工酶检测肿瘤细胞的传感器的制备方法，包括如下步骤：
[0014]制备人工酶
‑
检测抗体共轭物；
[0015]制备捕获电极；具体实施时，可以先制备人工酶
‑
检测抗体共轭物，然后制备捕获电极，也可以先制备捕获电极，然后制备人工酶
‑
检测抗体共轭物；
[0016]将捕获电极、目标循环肿瘤细胞进行混合孵育，加入人工酶
‑
检测抗体共轭物，通过免疫夹心引入人工酶，然后加入底物反应，人工酶催化底物得到沉淀物沉积在电极表面，即得所述的传感器。
[0017]具体制备过程如下：
[0018]制备人工酶
‑
检测抗体共轭物，包括：
[0019](1)制备Co3O4@MnO2@CDs多面体：
[0020]首先合成了金属有机框架材料衍生物Co3O4多面体。具体的，将六水合硝酸钴(2.9103g)和2
‑
甲基咪唑(3.2840g)分别溶解于甲醇(250mL)中。再将2
‑
甲基咪唑溶液加入硝酸钴溶液中搅拌10min，然后将制备好的混合溶液在室温下老化24h。沉淀物(金属有机框架材料)经甲醇多次洗涤，除去未反应的试剂，在60℃真空干燥箱中干燥过夜。然后将金属有机框架材料放置于管式炉中，加热速率为5℃/min，氩气氛围下维持350℃30min，以更好地保留与金属有机框架材料相似的形貌。然后将氩气关断，在空气中继续反应30min，Co3O4多面体由金属有机框架材料分解氧化而成；优选地，所述金属有机框架材料为ZIF
‑
67。
[0021]天平预热后，在称量纸上分别称量0.01g高锰酸钾、0.02g制备的Co3O4多面体。将高锰酸钾倒入30mL、0.1mol/L的KOH溶液中，充分搅拌使之分散均匀，随后加入Co3O4多面体粉末，超声30min。得到的混合液静置12h，静置过程中产物逐渐沉积在烧杯底部。待反应完成后，将固体物质离心分离，随后在60℃下真空干燥，所得产物即为Co3O4@MnO2多面体。
[0022]采用水热法制备了水溶性CDs，0.42g柠檬酸和0.536mL乙二胺溶解在10mL水中，装入30mL高压反应釜中。然后将高压反应釜放入200℃干燥箱中保持5h，产品经0.22μm过滤膜过滤后即可使用。
[0023]取2mg/mL上述所制备的Co3O4@MnO2多面体溶液加入4mL过滤后的CDs溶液，室温温和振摇12h，离心分离，制备Co3O4@MnO2@CDs多面体。
[0024](2)制备Co3O4@MnO2@CDs
‑
Ab2共轭物：
[0025]将目标检测抗体加入Co3O4@MnO2@CDs多面体溶液，并进行室温振摇孵育和离心处理，使得所述目标检测抗体和所述Co3O4@MnO2@CDs多面体通过共价键结合，制得Co3O4@MnO2@CDs
‑
Ab2共轭物溶液；其中，所述目标检测抗体用Ab2表示。
[0026]制备捕获电极，包括以下步骤：
[0027](1)制备二氧化钛/氧化铟锡电极：
[0028]配制二氧化钛纳米颗粒悬浮液(1.5mg/mL)；将所述二氧化钛纳米颗粒悬浮液滴加到氧化铟锡电极上，制得二氧化钛/氧化铟锡电极。
[0029](2)制备捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极：
[0030]将壳聚糖(0.5％，m/v)修饰在所述二氧化钛/氧化铟锡电极上，以氨基化二氧化钛纳米颗粒，再用戊二醛(2.5％，m/v)作为交联剂将捕获抗体通过共价键结合在所述壳聚糖/
二氧化钛/氧化铟锡电极表面上，制得捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极。
[0031](3)制备封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极：
[0032]将封闭剂占据所述二氧化钛纳米颗粒上的活性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器，其特征在于，包括捕获电极、循环肿瘤细胞、信号放大器和底物；所述捕获电极为负载有捕获抗体的电极；所述信号放大器为人工酶
‑
检测抗体共轭物；所述人工酶阻碍电子供体到达电极表面且催化底物得到沉淀物，所述沉淀物为电子受体且沉积在电极表面，所述检测抗体和捕获抗体均为循环肿瘤细胞表面抗原的特异性抗体。2.根据权利要求1的一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器，其特征在于，所述捕获电极为封闭剂/捕获抗体/壳聚糖/二氧化钛/氧化铟锡电极，该捕获电极是在氧化铟锡电极表面依次负载二氧化钛、壳聚糖、捕获抗体，然后采用封闭剂封闭后得到的；所述封闭剂用以占据二氧化钛纳米颗粒上的活性位点。3.根据权利要求1的一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器，其特征在于，所述人工酶为Co3O4@MnO2@CDs多面体，该人工酶是在Co3O4多面体上依次生长MnO2和CDs制备得到的，所述Co3O4多面体由ZIF
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67分解氧化而成。4.根据权利要求1的一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器，其特征在于，所述底物为过氧化氢和4
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氯
‑1‑
奈酚，所述沉淀物为4
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氯
‑1‑
奈醌。5.根据权利要求1的一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器，其特征在于，所述循环肿瘤细胞为A549细胞；捕获抗体和检测抗体为A549细胞表面上的抗原上皮细胞粘附分子的特异性抗体。6.权利要求1所述的一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：制备人工酶
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检测抗体共轭物；制备捕获电极；将捕获电极、目标循环肿瘤细胞进行混合孵育，加入人工酶
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检测抗体共轭物，然后加入底物反应，人工酶催化底物得到沉淀物沉积在电极表面，即得所述的传感器。7.根据权利要求1所述的一种人工酶检测肿瘤细胞的传感器的制备方法，其特征在于，制备人工酶
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检测抗体共轭物，包括如下步骤：（1）制备Co3O4@MnO2@CDs多面体：制备Co3O4多面体：采用金属有机框架材料ZIF
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67分解氧化制备Co3O4多面体；制备Co3O4@MnO2多面体：向高锰酸钾的KOH溶液中加入Co3O4多面体粉末，超声、静置反应，将固体物质离心分离、真空干燥，得到Co3O4@MnO2多面体；制备水溶性CDs：采用水热法制备水溶性CDs；制...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿有梅，杨瑞英，苏纾瑶，薛林生，李玉玲，刘慧敏，刘利娥，吴拥军，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：