一种亚磷酰胺单体以及纯化寡核苷酸的方法技术

本发明专利技术提供了一种亚磷酰胺单体以及使用其纯化寡核苷酸的方法，所述亚磷酰胺单体具有如下式I表示的结构，或其药学上可接受的盐，或其对映异构体、非对映异构体、互变异构体或溶剂化物。另外，本发明专利技术的方法使用含有能够进行聚合反应的甲基丙烯酰胺基团的亚磷酰胺单体作为合成寡核苷酸的原料，相比于现有的寡核苷酸纯化方法相比，具有合成纯化回收率高、设备及操作简单、且无交叉污染等诸多优点。且无交叉污染等诸多优点。且无交叉污染等诸多优点。

【技术实现步骤摘要】
一种亚磷酰胺单体以及纯化寡核苷酸的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2021年4月19日提交的申请号为202110417554.1、专利技术名称 为“一种亚磷酰胺单体以及纯化寡核苷酸的方法”的中国专利申请的优先权， 其全部内容通过引入并入本文。


[0003]本专利技术属于寡核苷酸合成领域，更具体地，本专利技术通常涉及一种亚磷酰 胺单体以及纯化寡核苷酸的方法。

技术介绍

[0004]现代的寡核苷酸合成主要采用可自动化的亚磷酰胺固相合成技术，每一 步的合成产率极限可以达到99.6％。尽管如此，随着寡核苷酸链长的增加， 杂质含量也会增加，例如以合成产率99％计算，对于20
‑
mer碱基长度的寡核 苷酸链，通常产率在80％左右，杂质含量在20％左右，对于40
‑
mer碱基长 度的寡核苷酸链，产率与杂质含量则分别为65％和35％左右。产生的杂质主 要来自合成及脱保护过程中产生的小分子、每一步偶联反应不完全造成的失 败序列、盖帽不完全造成的缺失序列以及多重偶联造成的插入序列等，其中， 失败序列是最主要的杂质。
[0005]为了除去杂质和纯化得到的寡核苷酸，目前有多种手段可以实现该目 的，常见的如体积排阻色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱法(包 含反相HPLC及离子交换HPLC)、纯化柱层析等，还有新技术如基于亲和力 的纯化方法(包括生物素
‑
亲和素亲和纯化以及氟原子亲和柱纯化)。然而， HPLC需要特殊仪器，且产生大量有机废液(如纯化5mg的寡核苷酸，需要 500L的溶剂)，且寡核苷酸的大规模纯化成本高昂；同时容易造成交叉污染， 如果需要避免交叉污染，则每一个不同序列都应配备单独的HPLC制备柱， 从而大大增加了纯化的成本；聚丙烯酰胺凝胶电泳操作复杂，难以实现高通 量纯化；体积排阻色谱法和纯化柱层析可以实现小规模的高通量纯化，但也 难以实现大规模的寡核苷酸纯化；基于捕获和释放策略，理论上可以解决交 叉污染的问题，也可以实现大规模的寡核苷酸纯化，但目前报道的合成纯化 的总体回收率仅为17.5％。
[0006]因此，开发新型的适用这种策略的单体将大大提高寡核苷酸的纯化效 率，并降低纯化的成本。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于克服现有技术方法在纯化寡核苷酸以及去除其中作为 最主要杂质的失败序列时存在成本高昂、难以实现高通量、或纯化回收率低 等缺陷，本专利技术提供一种能够大幅提高寡核苷酸的纯化效率和降低纯化成本 的方法，该方法使用含有能够进行聚合反应的甲基丙烯酰胺基团的亚磷酰胺 单体作为合成寡核苷酸的原料，具有合成纯化回收率高、设备及操作简单、 且无交叉污染等优点，本专利技术人也是基于上述发现完成了
本专利技术。
[0008]为了实现上述目的，在一方面，本专利技术提供了一种亚磷酰胺单体，所述 亚磷酰胺单体具有如下式I表示的结构，或其药学上可接受的盐，或其对映 异构体、非对映异构体、互变异构体或溶剂化物：
[0009][式I][0010][0011]其中，X为具有如下结构的刚性连接子：
[0012][0013]R1和R2均为
‑
O(CH2CH2O)
n
CH3，且分别取代在中间苯环上的两个任意 不同位置；R3至R10各自独立地选自氢、羟基、氰基、卤素、或者取代或 未取代的氨基、C1‑
C6烷基、C1‑
C6烷氧基或C3‑
C6环烷基；m为1至10的整 数；n为1至10的整数；并且Y为亚磷酰胺修饰的核苷，且所述核苷上的氨 基任选地被酰化，其中所述核苷可以为核糖核苷或脱氧核糖核苷。在本专利技术 的一个优选实施方式中，所述核苷为核糖核苷，所述核糖核苷包括胞苷(C)、 尿苷(U)、腺苷(A)、胸苷(T)或鸟苷(G)。在本专利技术的一个优选实施方 式中，所述核苷为脱氧核糖核苷，所述脱氧核糖核苷包括脱氧胞苷(C)、脱 氧尿苷(U)、脱氧腺苷(A)、脱氧胸苷(T)或脱氧鸟苷(G)。
[0014]如本文所用，术语“药学上可接受的盐”包括药学上可接受的酸加成盐 和药学上可接受的碱加成盐。其中，所述药学上可接受的酸加成盐是指能够 保留游离碱的生物有效性而无其它副作用的与无机酸或有机酸所形成的盐， 例如无机酸盐可以包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸 盐等；有机酸盐可以包括但不限于甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、 己酸盐、水杨酸盐等。药学上可接受的碱加成盐是指能够保持游离酸的生物 有效性而无其它副作用的与无机碱或有机碱所形成的盐，例如无机碱盐可以 包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、 锰盐、铝盐等；有机碱盐可以包括但不限于伯胺类、仲胺类及叔胺类盐。这 些盐可通过本专业已知的方法制备。
[0015]如本文所用，术语“酰化”(或称为“酰基化”)是指在有机分子中的氮、 氧、碳或硫等原子上引入脂肪族酰基RCO
‑
或芳香族酰基ArCO
‑
的反应，其 中本专利技术中适用的所述酰化可以包括但不限于甲酰化、乙酰化、丙酰化、异 丙酰化、苯酰化等；且常用的酰化剂可以包括例如酰氯、酸酐和羧酸，更具 体地，例如乙酰氯或乙酸酐等。
[0016]关于本专利技术的刚性连接子的具体结构，在本专利技术的一个优选实施方式中， R1和R2可以为彼此邻位、间位或对位取代；R3至R10可以各自独立地选 自氢、羟基、氰基、卤素、或者取代或未取代的氨基、C1
‑
C6烷基；m可以 为3至8(例如3、4、5、6、7或8)的整数；n可以为2至5(例如2、3、 4或5)的整数；并且Y可以为亚磷酰胺修饰的脱氧核糖核苷，所述脱氧核 糖核苷可以包括脱氧胞苷(C)、脱氧尿苷(U)、脱氧腺苷(A)、脱氧胸苷(T)或脱氧鸟苷(G)，且所
述核苷上的氨基可以任选地被酰化(并且在优 选的情况下，所述核苷上的氨基被酰化)。
[0017]进一步地，在本专利技术的一个优选实施方式中，R1和R2可以为彼此对位 取代。在本专利技术的一个优选实施方式中，R3至R10可以各自独立地选自氢、 羟基、氰基、卤素、或者取代或未取代的氨基、甲基、乙基、丙基、异丙基。
[0018]在本专利技术的一个优选实施方式中，所述取代可以为被卤素(例如氟、氯 或溴)、羟基、氨基、氰基、C1‑
C3烷基(例如甲基、乙基、丙基或异丙基) 或C1‑
C3卤代烷基(例如卤代甲基、卤代乙基或卤代丙基)取代，但不限于 此。另外，所述取代可以包括一个或多个取代，取代数量的上限可以取决于 氢的数量，即全部取代。进一步地，在本专利技术的一个优选实施方式中，R1 和R2为对位取代；R3至R10均选自氢；m为5；并且n为2。
[0019]在本专利技术的一个优选实施方式中，所述亚磷酰胺修饰中的修饰基团具有 如下结构：
[0020][0021]在本专利技术的一个优选实施方式中，所述亚磷酰胺单体可以进一步地表示 为具体的化合物，例如，其可以具有如下所示结构中的一种：
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种亚磷酰胺单体，其特征在于，所述亚磷酰胺单体具有如下式I表示的结构，或其药学上可接受的盐，或其对映异构体、非对映异构体、互变异构体或溶剂化物：[式I]其中，X为具有如下结构的刚性连接子：R1和R2均为
‑
O(CH2CH2O)
n
CH3，且分别取代在中间苯环上的两个任意不同位置；R3至R10各自独立地选自氢、羟基、氰基、卤素、或者取代或未取代的氨基、C1‑
C6烷基、C1‑
C6烷氧基或C3‑
C6环烷基；m为1至10的整数；n为1至10的整数；并且Y为亚磷酰胺修饰的核苷，且所述核苷上的氨基任选地被酰化。2.根据权利要求1所述的亚磷酰胺单体，其中，R1和R2为彼此邻位、间位或对位取代；R3至R10各自独立地选自氢、羟基、氰基、卤素、或者取代或未取代的氨基、C1‑
C6烷基；m为3至8的整数；n为2至5的整数；并且Y为亚磷酰胺修饰的脱氧核糖核苷，所述脱氧核糖核苷包括脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷或脱氧胞苷。3.根据权利要求1或2所述的亚磷酰胺单体，其中，R1和R2为彼此对位取代。4.根据权利要求1或2所述的亚磷酰胺单体，其中，R3至R10各自独立地选自氢、羟基、氰基、卤素、或者取代或未取代的氨基、甲基、乙基、丙基、异丙基。5.根据权利要求1
‑
2和4中任一项所述的亚磷酰胺单体，其中，所述取代为被卤素、羟基、氨基、氰基、C1‑
C3烷基或C1‑
C3卤代烷基取代。6.根据权利要求1所述的亚磷酰胺单体，其中，所述亚磷酰胺修饰中的修饰基团具有如下结构：7.根据权利要求1所述的亚磷酰胺单体，其具有如下所示结构中的一种：
8.一种纯化寡核苷酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)使寡核苷酸与根据权利要求1
‑
7中任一项所述的亚磷酰胺单体发生偶联反应，以使所述亚磷酰胺单体连接在所述寡核苷酸的末端，从而得到全长寡核苷酸；(2)聚合所述全长寡核苷酸；(3)从所聚合的全长寡核苷酸中去除失败序列；以及(4)回收所述全长寡核苷酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述寡核苷酸的长度为10
‑
100nt；优选为20

【专利技术属性】
技术研发人员：陈锦森，黄静，李竑，王建鹏，张有福，
申请(专利权)人：南京金斯瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：