一种添加抗冻蛋白利用PCR仪和PCR管实现的鸡精液冷冻方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种添加抗冻蛋白利用PCR仪和PCR管实现的鸡精液冷冻方法及其应用，所述方法可以利用PCR仪和PCR管实现可控降温平衡,实现优化的鸡精液冷冻曲线。利用上述方法获得的冻精可以实现受精率达到80%以上，DNA完整性更高的冷冻保存效果。与新鲜鸡精的相关数据相比，其精子活力、孵化率、DNA完整性上均接近于鲜精的人工授精效果，具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种添加抗冻蛋白利用PCR仪和PCR管实现的鸡精液冷冻方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物领域，涉及一种添加抗冻蛋白利用PCR仪和PCR管实现的鸡精液冷冻方法及其应用，及其进一步的涉及利用实验室常见仪器PCR仪和耗材PCR管实现可控降温平衡,实现优化的鸡精液冷冻曲线和优化的解冻方法。

技术介绍

[0002]精液冷冻保存是人工授精技术的一项重大革新。它解决了精液长期保存的问题，使精液不受时间、地域和种畜生命的限制，可充分利用良种最佳阶段的遗传性能，极大限度的发挥和提高优良种公鸡的利用率，大大提高遗传进展，加速品种的育成和改良步伐。同时，对优良种公鸡在短期进行后裔测定，保留和恢复某一品种或个体公鸡的优秀特性，以及在进行血统更新、引种、减低生产成本和品种资源保护等方面都具有重要意义和应用价值。
[0003]近50多年来，国内外学者及动物繁殖技术研究者对家畜、家禽的精液冷冻保存和人工授精技术进行了大量的研究。尤其，自1949年英国Polge等发现甘油(丙三醇)对牛精子具有抗冻保护作用后，该技术研究与应用取得了飞速的发展，尤其在乳牛上的应用效果已同鲜精无明显差异。因此国内外畜牧工作者已相继在牛、羊、马、猪、鸡、鸭、火鸡等种畜禽上开展了精液冷冻保存的研究，均取得了重大进展和显著效果。在家禽(鹅、鸡、鸭、火鸡等)主要从如下几方面进行了大量研究：目前鸡精液冷冻保护剂主要有甘油、DMSO(二甲亚砜)、DMA(N，N
‑
二甲基乙酰胺)以及EG(乙二醇)等。但另一方面也发现这些化学成分对精子也有一定的毒害作用(即抗受精作用)。尤其是本专利技术的前期试验表明，甘油、DMSO、DMA、EG对精子的存活都会产生较显著的毒害作用(P＜0.05)，其中以DMA的毒性最小，乙二醇和DMSO次之。可见，筛选出高效、无毒的、优良冷冻保护剂是种公鸡精液冷冻的重要环节之一。而且精液冷冻保存不仅涉及到保存液，还涉及到冷冻的具体步骤、解冻的具体步骤，这些都会直接影响到最终的受精效果。
[0004]在具体的生产实践中，例如大规模化的养鸡场中，鸡精液过程可以分为采精、一次稀释、平衡、二次稀释、分装、冷冻、解冻检测、保存等几个步骤，整个过程中温度时间控制、试剂、稀释比例和稀释方法等许多方面都会对最终解冻活力和配种效果产生影响。现在鸡冻精技术的自动化程度还很低，只有冷冻过程对自动化设备有所应用，标准化程度很低，这就使得不同学者做出来的效果差异很大。
[0005]而常规的鸡冻精按照剂型大致可以分为颗粒冻精和细管冻精两种方式。按照冷冻方法，可以分为简易熏蒸、专用程序冷冻仪冷冻两种方式，前者不需要专用设备，但冷冻效果因人而异，受技术员个人因素影响很大。后者根据需要设定降温曲线，设备自动控温，可以减少人为因素的影响，但是操作繁琐，效果不稳定。
[0006]现有技术中对此有很多研究，但大多都效果不理想，例如：现在最常用的方法是精液平衡采用纱布包裹或置于盛水烧杯中再放冰箱冷藏，自然降温，这种方法简单易操作，但是效果极其不稳定，不能精准控制降温速率，由于降温速率与温差成正比，降温过程先快后
慢，容易导致低温打击。或者用简易熏蒸架子和泡沫箱熏蒸，根据距离液面的高度来调整冷冻速率，从而改变冷冻效果，但是这种方法中由于空气流动性特别强，很容易产生强烈的扰动，加上不同泡沫箱的保温性能不同，深度不同，环境温度不同，距液氮面同一高度的位置温度都会不一样，并且随着液氮的蒸发，同一套装置在不同时间的温度分布也会产生显著遍变化。这些不可控的因素导致简易熏蒸方式效果不稳定。期刊论文《Effect of the Interaction Between Cryoprotectant Concentration and Cryopreservation Method on Frozen/Thawed Chicken Sperm Variables》中公开了一种使用程序冷冻仪冷冻的冷冻曲线，以7℃/min从5℃降至
‑
35℃，然后以
‑
60℃/min的速率降低
‑
140℃，这种方法虽然可以精确控温，但是形成冰晶的危险温度区间是0～
‑
60℃，降温过程中精子细胞外会先冻结，导致水分析出，未冻结部分溶液浓度增大，进而导致精子脱水，若降温速率太慢，精子脱水太严重，从而导致细胞损伤。另外，本领域内常采用采用0.25ml麦管作为容器，使用注射器或者移液器等工具手动灌装的方法进行操作，但是由于鸡的精液量特别少，即使稀释完后也只能灌装几支麦管，难以使用自动灌装封口机进行灌装封口，手动灌装通常很难控制灌装量。灌装后还需进行封口操作，额外需要手动封口机。细管冻精解冻后还需要解冻至离心管中才能用于种鸡输精，增加了精液损耗和操作过程。

技术实现思路

[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术的目的是：提供一种精液平衡过程精准可控、灌装封口简便易行、冷冻曲线优化的鸡冻精方案及配套的解冻方法。
[0008]所述方法是基于专利技术人在前期研究中通过技术突破获得了一种鸡精液冷冻保存稀释液，分为I液和II液；I液包括：果糖5~10g、海藻糖8~20g、一水柠檬酸钾1~3g、四水醋酸镁4~6g、谷氨酸钠11~19g、Tris（三羟甲基氨基甲烷）8~13g、还原型谷胱甘肽0.1~0.5g、氧化型谷胱甘肽0.05~0.1g，溶于1000ml水，然后加入松针抗冻多肽（1mg/ml,溶于0.01M PBS缓冲液）1~5ml。取I液660ml加入DMA 80~120ml，即为II液；所述松针抗冻多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(Ser
‑
Ala
‑
Arg
‑
Glu
‑
Arg
‑
Thr
‑
Cys
‑
Thr
‑
Ser
‑
Ser
‑
Thr
‑
Asn
‑
Ser
‑
Lys
‑
Ala
‑
Cys
‑
Ala
‑
Lys
‑
Tyr
‑
Thr
‑
Pro
‑
Thr
‑
Asp
‑
Thr
‑
Cys
‑
Thr)进一步的，本专利技术提供一种利用上述稀释液对鸡精进行冷冻的优化方法，包括步骤：将松针抗冻多肽，果糖、海藻糖、一水柠檬酸钾、四水醋酸镁、谷氨酸钠、Tris、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽，溶于双蒸水，定容至1000ml，充分溶解，为I液，取I液660ml，加入DMA 80~120ml，为II液，I、II液均用0.22um滤器过滤除菌，分装至2ml离心管保存。
[0009]使用时用将I液于37℃预热，充分混匀后与原精进行等温稀释，原精:I液=1:2，用移液器将上述稀释后的精液按每份80ul的量分装至200ul 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用PCR仪和PCR管实现可控降温平衡,实现优化的鸡精液冷冻曲线，其特征在于所述鸡精液冷冻曲线为：用移液器将利用鸡精液冷冻保存稀释液I液进行稀释的精液按每份80ul的量分装至200ul PCR管，然后将其置于PCR仪上，设定降温速度0.5~3℃/min，使精液降温至3~6℃，然后加入预冷的鸡精液冷冻保存稀释液II液进行1:1稀释，继续平衡10~20min，平铺在直径15~20cm的粗网筛，用冷冻仪冷冻，冷冻曲线以3~10℃/min从5℃降至
‑
10℃，然后以
‑
30~
ꢀ‑
40℃/min的速率降低至
‑
100℃以下，随后投入液氮保存。2.如权利要求1所述的鸡精液冷冻曲线，其中所述鸡精液冷冻保存稀释液包括鸡精液冷冻保存稀释液I液和鸡精液冷冻保存稀释液II液，鸡精液冷冻保存稀释液I液包括：松针抗冻多肽、果糖、海藻糖、一水柠檬酸钾、四水醋酸镁、谷氨酸钠、Tris（三羟甲基氨基甲烷）、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽，其中，上述各成分的配比为（1000ml）：果糖5~10g、海藻糖8~20g、一水柠檬酸钾1~3g、四水醋酸镁4~6g、谷氨酸钠11~19g、Tris（三羟甲基氨基甲烷）8~13g、还原型谷胱甘肽0.1~0.5g、氧化型谷胱甘肽0.05~0.1g，余量为双蒸水，然后加入松针抗冻多肽（1ml/ml,溶于0.01M PBS缓冲液）1~5ml；所述松针抗冻多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；鸡精液冷冻保存...

【专利技术属性】
技术研发人员：周迪，任丽群，蒋桂荣，赵忠海，李俊，谢玲玲，李辉，王府，杨蓉，沈银，陈昌雪，严兴烨，
申请(专利权)人：贵州省种畜禽种质测定中心，
类型：发明
国别省市：