提高猪精液冷冻保存品质的方法技术

本发明专利技术提供一种提高猪精液冷冻保存品质的方法，通过向猪精液稀释液中添加0.01

【技术实现步骤摘要】
提高猪精液冷冻保存品质的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种提高猪精液冷冻保存品质的方法。

技术介绍

[0002]近年来，猪人工授精在家畜养殖上得到愈来愈普遍的应用，尤其是对于规模化、集约化、专业化养殖，人工授精技术发挥了重要作用。精液冷冻保存技术保证了人工授精对精液的需求不受时间和地域的限制。冷冻保存技术使得采精和受精在时间和空间上产生了分离，延长了精子的体外储存时间，便于长途运输，促进了遗传资源跨地区、跨国界的交流和共享，加快了畜群品种改良步伐，使得优秀畜种得到大范围的推广。
[0003]精子的冷冻保存是一个复杂的过程，为了获得令人满意的冻存结果，在冷冻过程中需要平衡多种因素。需要适宜的稀释剂、抗冻剂及其他添加剂，平衡温度和平衡时间、降温速率及解冻速率都是至关重要的，其每一项都有可能影响精液质量。在精液冷冻保存中，冷冻保护剂是精子超低温冻贮成功与否的关键。它主要作用是减少冷冻和解冻过程中细胞渗透性损伤和减少冰晶形成，细胞得以在超低温条件下保存。
[0004]目前，冷冻保护剂主要分为渗透性冷冻保护剂(如甘油、乙二醇等)和非渗透性冷冻保护剂(如单糖、卵黄、白蛋白等)。一般认为卵黄由于富含卵磷脂，能提高细胞外渗透压，稳定精子细胞膜，防止顶体外膜破裂作用，研究表明，在非冷冻条件下，卵黄能促进精子与卵透明带结合，从而提高顶体反应率。然而由于卵黄和尿道球腺分泌物之间存在着有害的相互作用，会使复温后精子存活率下降。
[0005]在过去的50年中冷冻精液技术迅猛发展，不同动物的精液冷冻都获得了较快的进展，牛的冷冻精液已经进入了产业化。猪的精子与其他家畜相比具有一定生理特性，冷冻后活力低、受胎率低，且不稳定，成为制约猪冷冻精子发展的桎梏。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种提高猪精液冷冻保存品质的方法。
[0007]为了提高猪冷冻精液解冻后活力以及存活时间，提升猪冷冻精液品质，本专利技术提供了添加抗氧化剂MitoQ的猪冷冻精液的制备方法。Mitoquinone(MitoQ)是一种新型线粒体靶向抗氧化剂，具有神经保护作用，包括增强神经和运动功能，以及减少氧化应激、细胞凋亡等作用。此外，MitoQ能够通过降低线粒体氧化损伤保护线粒体，从而降低细胞氧化应激水平，提高生殖细胞冷冻后活力。向稀释液内添加10μMMitoQ对猪精液进行冷冻保存，可显著提高猪精子冻后质量，包括冻后活力，运动能力显著提升，维持质膜和DNA完整，保护顶体和线粒体不受损伤。
[0008]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供MitoQ在提高猪精液冷冻保存品质中的应用。
[0009]第二方面，本专利技术提供一种提高猪精液冷冻保存品质的方法，将猪精液与含有0.01
‑
40μM MitoQ的精液稀释液等体积混合后进行冷冻。
[0010]优选地，精液稀释液中MitoQ的终浓度为5μM、10μM、20μM或40μM，更优选10μM。
[0011]前述的方法，将采集的猪精液与预热至37℃的基础稀释液等体积混合进行稀释，在室温静置1
‑
2h，然后将猪精液与I液分别放入17℃恒温箱中平衡1
‑
2h；将平衡后的猪精液于17℃800g离心12
‑
20min；如果上清液中精子多可适当延长时间，收集上清液并测定上清液的体积和密度，计算总精子数，如果上清液中精子数超过10亿则需再次离心。离心后弃上清，用预热至37℃的I液对精子进行重悬，重悬后使精子密度达到20亿/ml，将重悬后的猪精液从17℃缓慢降温到4℃(2.5
‑
3h)，并将猪精液与Ⅱ液等体积混合后放入4℃冰箱中平衡0.5
‑
1h；最后，将平衡后的猪精液与4℃的II液等体积混合置于冻精细管中，可于液氮中长期冷冻保存。
[0012]其中，所述基础稀释液为：葡萄糖3.7g，EDTA0.125g，柠檬酸钠0.6g，碳酸氢钠0.125g，氯化钾0.075g，100IU青链霉素混合液(抑菌物质)10mL，加水定容至100mL。
[0013]所述I液为：乳糖4.25g，海藻糖4.25g，20mL鸡蛋卵黄液，加水定容至100mL。
[0014]所述II液为：甘油6mL，MitoQ 5
‑
40μM，加入I液定容至100mL。
[0015]进一步地，冷冻保存后，解冻的方法包括：将冻精细管从液氮中取出，放入50℃水浴锅内摇晃16s后取出，再将冻精细管中的猪精液与预热至37℃的基础稀释液混合，用于后续检测或实验。
[0016]第三方面，本专利技术提供一种含有0.01
‑
40μM MitoQ的猪精液稀释液。
[0017]优选地，猪精液稀释液中MitoQ的终浓度为5μM、10μM、20μM或40μM，更优选10μM。
[0018]第四方面，本专利技术提供一种用于提高猪精液冷冻保存品质的试剂盒，所述试剂盒包含上述猪精液稀释液。
[0019]第五方面，本专利技术提供上述猪精液稀释液在提高猪精液低冷冻保存品质方面的应用。
[0020]通过向猪精液稀释液中添加0.01
‑
40μM(如5μM、10μM、20μM、40μM)MitoQ，冷冻保存，其中10μM MitoQ可明显改善冷冻保存的猪精液品质；同时提高猪精子的运动能力，提高精子质膜完整性、线粒体活性。MitoQ能够通过降低线粒体氧化损伤保护线粒体，降低细胞氧化应激水平，从而提高生殖细胞冷冻后活力。
[0021]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
[0022](一)本专利技术提供一种可以提高猪精液冷冻保存品质的精液稀释液，即通过添加MitoQ来提高动物精液保存品质。本专利技术提供的精液稀释液能够显著提高精液冷冻保存活性，延长精子体外保存时间；同时，冷冻解冻后精子活力与对照组相比能提高15％左右。
[0023](二)本专利技术操作简便，应用成本低，效果显著，对猪不产生任何有害影响。可以为猪精液保存提供一定的数据支撑，在猪精液保存及相关的胚胎移植产业(人工授精技术)和胚胎工程中广泛应用，具有广阔的市场前景。
附图说明
[0024]图1为本专利技术较佳实施例中II液A、B、C、D、E中分别添加0μM、5μM、10μM、20μM、40μM MitoQ对精子冷冻保存活率影响的柱状图。
[0025]图2为本专利技术较佳实施例中II液A、B、C、D、E中分别添加0μM、5μM、10μM、20μM、40μM MitoQ对精子冷冻保存活力影响的柱状图。
[0026]图3为本专利技术较佳实施例中II液A、B、C、D、E中分别添加0μM、5μM、10μM、20μM、40μM MitoQ对精子冷冻保存DNA完整性影响的柱状图。
[0027]图4为本专利技术较佳实施例中II液A、B、C、D、E中分别添加0μM、5μM、10μM、20μM、40μM MitoQ对精子冷冻保存质膜完整性影响的柱状图。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.MitoQ在提高猪精液冷冻保存品质中的应用。2.提高猪精液冷冻保存品质的方法，其特征在于，将猪精液与含有0.01
‑
40μMMitoQ的精液稀释液混合后进行冷冻。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，精液稀释液中MitoQ的终浓度为5μM、10μM、20μM或40μM，优选10μM。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将采集的猪精液与预热至37℃的基础稀释液等体积混合进行稀释，在室温静置1
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2h，然后将猪精液与I液分别放入17℃恒温箱中平衡1
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2h；将平衡后的猪精液于17℃800g离心12
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20min；收集上清液并测定上清液的体积和密度，计算总精子数，如果上清液中精子数超过10亿则需再次离心；离心后弃上清，用预热至37℃的I液对精子进行重悬，重悬后使精子密度达到20亿/...

【专利技术属性】
技术研发人员：石磊，张燕，黄晓宇，邢建东，程煦，曹果清，孙迪，史明月，张燕伟，靳天宇，李文新，
申请(专利权)人：山西猪巴巴种猪育种有限公司，
类型：发明
国别省市：