一种米黑根毛霉糖苷水解酶12家族木葡聚糖酶的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种米黑根毛霉糖苷水解酶12家族木葡聚糖酶的制备方法及应用。本发明专利技术通过将巴斯德毕赤酵母的FLD1基因和酿酒酵母的Sso1基因与目的蛋白质RmXEG12A共表达，构建出产木葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌，提高RmXEG12A的分泌表达水平。RmXEG12A在5L发酵罐中高密度发酵，发酵液的酶活力可达25700U/mL。本发明专利技术提供的蛋白质RmXEG12A具有良好水解特性，高效水解富含木葡聚糖的罗望子粉和罗望子胶生成不同聚合度的木葡寡糖，将木葡寡糖制备益生元酸奶可增加酸奶的持水力，提升酸奶的品质。因此本发明专利技术所得木葡聚糖酶RmXEG12A在食品工业中具有重要的应用潜力和发展前景。具有重要的应用潜力和发展前景。

【技术实现步骤摘要】
一种米黑根毛霉糖苷水解酶12家族木葡聚糖酶的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种米黑根毛霉糖苷水解酶12家族木葡聚糖酶的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]木葡聚糖是一类主链由D
‑
吡喃葡萄糖残基以β
‑
1,4
‑
糖苷键相连形成，主链上60％
‑
75％的葡萄糖残基O
‑
6被α
‑
D
‑
吡喃木糖所取代形成的长链多聚糖。通常，木葡聚糖侧链的木糖基团进一步被β
‑
D
‑
1,2
‑
半乳糖和α
‑
D
‑
1,2
‑
岩藻糖取代，有时木葡聚糖中也存在极少量的阿拉伯糖。木葡聚糖中主要含有葡萄糖、木糖和半乳糖，其残基比例约为4:3:1(Kiefer et al.Carbohydrate Research,1990,197:139
‑
158)。由于木葡聚糖的侧链较复杂，一般采用系统命本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产木葡聚糖酶的方法，包括如下步骤：(A)将来源于米黑根毛霉CAU432的木葡聚糖酶XEG12A的编码基因、来源于毕赤酵母的FLD1蛋白的编码基因、来源于酿酒酵母的Sso1蛋白的编码基因导入受体毕赤酵母，得到重组毕赤酵母；(B)按照如下步骤对所述重组毕赤酵母进行发酵培养，从发酵产物中获得木葡聚糖酶XEG12A：B1)基础发酵培养：将所述重组毕赤酵母接种于BSM培养基中培养，待甘油消耗完全进行甘油补料发酵阶段；B2)甘油补料发酵阶段：在步骤B1)的基础上，将甘油以15
‑
30mL/h/L起始发酵液的速度流加到发酵体系中，待菌体湿重达180
‑
220g/L，停止流加甘油，饥饿0.5
‑
1h左右，然后进行甲醇补料诱导表达阶段；B3)甲醇补料诱导表达阶段：在步骤B2)的基础上，将甲醇流加到发酵体系中4h内使流速从3.6mL/h/L起始发酵液增加至10.9mL/h/L起始发酵液，然后维持10.9mL/h/L起始发酵液速度流加甲醇至发酵结束。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(A)中，所述来源于米黑根毛霉CAU432的木葡聚糖酶XEG12A为如下任一所示蛋白质：a1)SEQ ID No.1自N末端第21至242位氨基酸残基组成的蛋白质；a2)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；a3)将a1)或a2)所述的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有木葡聚糖酶活性的蛋白质；a4)与a1)
‑
a3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有木葡聚糖酶活性的蛋白质；a5)在a1)
‑
a4)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；和/或步骤(A)中，所述来源于毕赤酵母的FLD1蛋白为如下任一所示蛋白质：b1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b2)将b1)所述的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同活性的蛋白质；b3)与b1)
‑
b2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且相同活性的蛋白质；b4)在b1)
‑
b3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；和/或步骤(A)中，所述来源于酿酒酵母的Sso1蛋白为如下任一所示蛋白质：c1)由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c2)将c1)所述的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同活性的蛋白质；c3)与c1)
‑
c2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且相同活性的蛋白质；c4)在c1)
‑
c3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(A)中，所述来源于米黑根毛霉CAU432的木葡聚糖酶XEG12A的编码基因是通过重组载体1的形式导入所述受体毕赤酵母中的；进一步地，所述重组载体1为将所述来源于米黑根毛霉CAU432的木葡聚糖酶XEG12A的编码基因插入到pPIC9K载体的多克隆位点后得到的重组质粒；和/或步骤(A)中，所述来源于毕赤酵母的FLD1蛋白的编码基因是通过重组载体2的形式导入所述受体毕赤酵母中的；进一步地，所述重组载体2为将所述来源于毕赤酵母的FLD1蛋白的编码基因插入到pPICZA载体的多克隆位点后得到的重组质粒；和/或步骤(A)中，所述来源于酿酒酵母的Sso1蛋白的编码基因是通过重组载体3的形式导入所述受体毕赤酵母中的；进一步地，所述重组载体3为将所述来源于酿酒酵母的Sso1蛋白的编码基因插入到pGAPZB载体的多克隆位点后得到的重组质粒；和/或所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。4.根据权利要求1
‑
3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(A)中，所述来源于米黑根毛霉CAU432的木葡聚糖酶XEG12A的编码基因为如下任一所示的DNA分子：d1)SEQ ID No.4的自5
′
末端第61
‑
729位所示的DNA分子；d2)SEQ ID No.4所示的DNA分子；d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的DNA分子杂交且编码所述来源于米黑根毛霉CAU432的木葡聚糖酶XEG12A的DNA分子；d4)与d1)
‑
d3)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述来源于米黑根毛霉CAU432的木葡聚糖酶XEG12A的DNA分子；和/或步骤(A)中，所述来源于毕赤酵母的FLD1蛋白的编码基因为如下任一所示的DNA分子：e1)SEQ ID No.5所示的DNA分子；e2)在严格条件下与e1)限定的DNA分子杂交且编码所述来源于毕赤酵母的FLD1蛋白的DNA分子；e3)与e1)
‑
e2)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述来源于毕赤酵母的FLD1蛋白的DNA分子；和/或步骤(A)中，所述来源于酿酒酵母的Sso1蛋白的编码基因为如下任一所示的DNA分子：f1)SEQ ID No.6所示的DNA分子；f2)在严格条件下与f1)限定的DNA分子杂交且编码所述来源于酿酒酵母的Sso1蛋白的DNA分子；f3)与f1)
‑
f2)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％...

【专利技术属性】
技术研发人员：江正强，王楠楠，闫巧娟，李延啸，苗妙，杨绍青，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：