一种棘孢曲霉YS-1代谢产物的制备优化方法技术

本发明专利技术属于提取条件优化技术领域，公开了一种棘孢曲霉YS

【技术实现步骤摘要】
一种棘孢曲霉YS
‑
1代谢产物的制备优化方法


[0001]本专利技术属于提取条件优化
，尤其涉及一种棘孢曲霉YS
‑
1代谢产物 的制备优化方法。

技术介绍

[0002]目前，柑橘黄龙病Huanglongbing，HLB是柑橘产业最严重的毁灭性病害。 最早在18世纪，印度中部和东北部就有疑似黄龙病症状的记载，称为“梢枯病”。 目前在中国的11个省区已经发现柑橘黄龙病。因其具有难发现，传播快，无法 根治，毁灭性强等特点，严重地威胁着柑橘产业的发展。目前，针对柑橘黄龙 病的防治主要是采取“三板斧”综合防控技术，即砍除病株，种植无毒苗，防 治亚洲柑橘木虱。其中，防治亚洲柑橘木虱能有效控制柑橘黄龙病在植株间的 传播。
[0003]亚洲柑橘木虱Diaphorina citri kuwayama(以下简称柑橘木虱)属半翅目 Hemiptera，木虱科Psyllidae，是自然界中传播柑橘黄龙病的最主要媒介昆虫。 现阶段防治柑橘木虱的主要方法仍是化学防治。由于柑橘木虱繁殖能力强、世 代重叠严重，不科学用药导致柑橘木虱抗药性增强、防治成本升高。需要寻求 对环境更友好，更环保的替代物。
[0004]研究发现棘孢曲霉作为昆虫病原菌，对柑橘木虱具有良好的防效。防效结 果显示，随着曲霉YS
‑
1孢子浓度增加，试虫死亡率逐渐增加。曲霉YS
‑
1处理 试虫5d后，LC
50
为3.017
×
106个/mL，1
×
107个/mL曲霉YS
‑
1孢子悬浮液处理 5d后，柑橘木虱的校正死亡率为71.4％，死虫的僵虫率为88.1％。
[0005]表1曲霉YS
‑
1对柑橘木虱的毒力测定
[0006][0007]但是虫生真菌对寄主的侵染一般要经历10个阶段：分生孢子的附着
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孢子萌 发
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芽管穿透表皮
‑
菌丝在血腔中生长
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产生毒素
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寄主死亡
‑
菌丝入侵所有器官
‑
菌 丝穿出表皮
‑
产生分生孢子
‑
分生孢子扩散。这个过程需要很长的时间，且真菌孢 子的萌发要求较高的湿度，而且在柑橘木虱发生的高峰期时往往伴随着高温低 湿的环境，并不利于孢子萌发侵染木虱。
[0008]昆虫的致死原因，除了由于失水而使组织破坏等因素外，真菌产生的次生 代谢物
‑
毒素是致死的最重要的因子。目前已在白僵菌次生代谢中发现的重要毒 素主要有3种：白僵菌素、白僵菌交酯和球孢交酯。纯化的白僵菌素可使细胞 核变形，组织崩解，同时可诱导与肿瘤坏死因子(TNFE)引起的类似于细胞程 序性死亡的一种细胞死亡。球孢交酯能引起五龄家蚕Bombyx mori幼虫肌肉迟缓， 最后死亡。Hamill RL等首次发现白僵菌素(BEA)的杀虫活性，后来有学者发现 微克级的BEA即对红头丽蝇、埃及伊蚊、草盲蝽、草地贪夜蛾、麦二叉蚜等具 有杀虫效果。目前，BEA在工业上主要用作真菌性杀虫剂，是一种完全天然无 毒的生物农药，在安全性和环境保护方面优于多数植源性农药，可用于农业或 林业防治多
种害虫。
[0009]目前真菌次生代谢产物的提取技术主要为浸泡和索氏提取，新型的提取方 法包括微波、超临界流体和超声波辅助提取等，这些方法借助外力作用，加快 对细胞的破坏使内容物快速得到释放，可进一步提高提取效率。利用超声辅助 提取法，借助气超声波空化作用，导致细胞膜变形破坏，使内容物加速释放从 而推动整个提取过程的进行。所以超声波震荡的时间和温度对提取效果有很大 的影响。真菌次生代谢产物具有一定的极性，在一定的极性条件才最适合将其 浸出，过高或过低的甲醇体积分数和不合适的料液比均不利于棘孢曲霉次生代 谢产物的浸出。
[0010]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：棘孢曲霉侵染柑橘木虱需 要较长的时间，从喷施到出现高死亡率需要3
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7d时间，而且在柑橘木虱发生的 高峰期时往往伴随着高温低湿的环境，并不利于孢子萌发侵染木虱。而合适的 提取条件可以将具有杀虫活性的次生代谢物更好的提取出来，从而达到更好的 杀虫效果。

技术实现思路

[0011]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种棘孢曲霉YS
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1代谢产物的制 备优化方法，尤其涉及一种基于药效筛选和正交试验优化的棘孢曲霉YS
‑
1代谢 产物的制备优化方法及其应用。
[0012]本专利技术是这样实现的，一种棘孢曲霉YS
‑
1代谢产物的制备优化方法，所述 棘孢曲霉YS
‑
1代谢产物的制备优化方法包括：
[0013]将棘孢曲霉加入有机试剂甲醇超声波震荡，得浸膏，用纯净水超声波震荡 至完全溶解，得到浓缩液；
[0014]选取时间、液料比、甲醇浓度、温度四个因素的不同水平进行优化，得到 最优解。
[0015]进一步，所述制备优化方法：
[0016]取500mg的棘孢曲霉孢子粉和15ml的甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯或石油醚 进行超声波震荡，旋转蒸发后得浸膏并定量；
[0017]利用喷雾塔将浓缩液喷洒于试虫体表，然后将其饲养于装有新鲜九里香叶 的杯中，并放置于恒温培养箱，温度26
±
1℃，相对湿度80
±
5％，光照L:D＝14:10； 处理和对照每组所用的试虫均为30头，每12h观察一次死亡率。以观察代谢物 得杀虫活性，以观察代谢物得杀虫活性。
[0018]进一步，所述制备优化方法：
[0019]料液比2：50(ml/mg)称取棘孢曲霉孢子，加入85％甲醇，温度为50℃下 分别超声波震荡提取60min，趁热14000rpm离心10min，取上清液到新的管中， 真空旋转浓缩仪蒸干后，加入1ml纯净水超声波震荡至完全溶解，得到浓缩液。
[0020]进一步，利用喷雾塔将浓缩液喷洒于试虫体表，然后将其饲养于装有新鲜 九里香叶的杯中，并放置于恒温培养箱，温度26
±
1℃，相对湿度80
±
5％，光照L:D＝14:10；处理和对照每组所用的试虫均为30头，每12h观察一次死亡率， 以观察代谢物得杀虫活性；在设置的提取条件下，棘孢曲霉次生代谢物对柑橘 木虱的72h致死率为90.59％；所述棘孢曲霉YS
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1于2020年7月7日保存在广 东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61081；分类为棘孢曲霉 Aspergillus aculeatus，命名编号为棘孢曲霉YS
‑
1。
[0021]进一步，所述棘孢曲霉YS
‑
1代谢产物的制备优化方法包括以下步骤：
[0022]步骤一，将棘孢曲霉培养发酵，获得对木虱有强侵染力的孢子；<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种棘孢曲霉YS
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1代谢产物的制备优化方法，其特征在于，所述棘孢曲霉YS
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1代谢产物的制备优化方法包括：将棘孢曲霉加入有机试剂甲醇超声波震荡，得浸膏，用纯净水超声波震荡至完全溶解，得到浓缩液；选取时间、液料比、甲醇浓度、温度四个因素的不同水平进行优化，得到最优解。2.如权利要求1所述的棘孢曲霉YS
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1代谢产物的制备优化方法，其特征在于，所述制备优化方法：取500mg的棘孢曲霉孢子粉和15ml的甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯或石油醚进行超声波震荡，旋转蒸发后得浸膏并定量；利用喷雾塔将浓缩液喷洒于试虫体表，然后将其饲养于装有新鲜九里香叶的杯中，并放置于恒温培养箱，温度26
±
1℃，相对湿度80
±
5％，光照L:D＝14:10；处理和对照每组所用的试虫均为30头，每12h观察一次死亡率，以观察代谢物得杀虫活性。3.如权利要求1所述的棘孢曲霉YS
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1代谢产物的制备优化方法，其特征在于，所述制备优化方法：料液比2：50(ml/mg)称取棘孢曲霉孢子，加入85％甲醇，温度为50℃下分别超声波震荡提取60min，趁热14000rpm离心10min，取上清液到新的管中，真空旋转浓缩仪蒸干后，加入1ml纯净水超声波震荡至完全溶解，得到浓缩液。4.如权利要求1所述的棘孢曲霉YS
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1代谢产物的制备优化方法，其特征在于，利用喷雾塔将浓缩液喷洒于试虫体表，然后将其饲养于装有新鲜九里香叶的杯中，并放置于恒温培养箱，温度26
±
1℃，相对湿度80
±
5％，光照L:D＝14:10；处理和对照每组所用的试虫均为30头，每12h观察一次死亡率，以观察代谢物得杀虫活性；设置提取温度50℃、提取时间60min，甲醇体积分数85％，料液比2：50(ml/mg)，在设置的提取条件下，棘孢曲霉次生代谢物对柑橘木虱的72h致死率为90.59％；所述棘孢曲霉YS
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1于2020年7月7日保存在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61081；分类为棘孢曲霉Aspergillus aculeatus，命名编号为棘孢曲霉YS
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1。5.如权利要求1所述的棘孢曲霉YS
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【专利技术属性】
技术研发人员：王宁，彭媛媛，蒋红波，娄兵海，李怡杰，宋雅琴，
申请(专利权)人：广西特色作物研究院，
类型：发明
国别省市：