一种普鲁兰酶制造技术

本发明专利技术属于酶工技术程领域，具体涉及普鲁兰酶酶分子的组合定点突变、突变体的筛选与表达制备。本发明专利技术以SEQ ID NO.2所示氨基酸的长野芽胞杆菌普鲁兰酶(PulA)为基础，通过定向分子进化，获得最适作用温度得到提高或降低、最适作用pH得到提高或降低、以及异源表达的水平显著提高的普鲁兰酶突变体，由此可改善普鲁兰酶的应用性能并拓展其应用领域，提升普鲁兰酶工业规模下的制造效率。工业规模下的制造效率。工业规模下的制造效率。

【技术实现步骤摘要】
一种普鲁兰酶
[0001]本申请为专利技术专利申请202011380782.8的分案申请，202011380782.8的申请日为2020年12月1日，申请号为202011380782.8，专利技术名称为：一种普鲁兰酶突变体。

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[0002]本专利技术属于酶工程
，具体涉及普鲁兰酶酶分子的组合定点突变、突变体的筛选与表达制备。

技术介绍
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[0003]自然界通过光合作用等形成的淀粉分子，是人类生活最重要的原材料。淀粉由葡萄糖聚合而成，以α
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1,4和α
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1,6糖苷键作为重要的多糖类物质，可作为初级原料用于食品、酿造、制药等行业中，是除纤维素之外由植物产生的最丰富的多糖。淀粉分为寡分支的直链淀粉和多分支的支链淀粉，其中75％
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80％都是支链淀粉。直链淀粉中的葡萄糖由α
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1,4糖苷键连接成线状分子，而在支链淀粉的分支点处由α
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1,6糖苷键连接而成。
[0004]淀粉中α
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1,6糖苷键的水解是淀粉综合加工与淀粉生物利用的限速步骤。为了提高淀粉的酶法水解效率、减少相关酶制剂的使用量、提高淀粉的生物利用度以及以淀粉为原料的食品加工、淀粉衍生新产品的生产，在淀粉加工和淀粉生物转化过程中，需要对淀粉分子中的α
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1,6糖苷键进行水解。然而，绝大多数α
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淀粉酶的水解位点为α
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1,4糖苷键，糖化酶尽管具有较弱的α
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1,6糖苷键水解活性，但仅能缓慢水解淀粉分子中的α
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1,6糖苷键，仅用现有的α
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淀粉酶及糖化酶无法高效地完成对淀粉的完全水解，单独、同步或分步使用淀粉脱支酶，可以极大程度的提高淀粉到直链分子生成量、淀粉到葡萄糖或麦芽糖的糖化效率、并显著降低糖化酶、β
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淀粉酶等酶的使用量【van der Maarel M J，van der Veen B，Uitdehaag J C，et al.Properties and applications of starch
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converting enzymes of theα
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amylase family[J].Journal of Biotechnology，2002，94(2)：137
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155.】。
[0005]已经发现，多种酶制剂具有专业水解淀粉分子中α
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1,6糖苷键，包括异淀粉酶和普鲁兰酶。其中普鲁兰酶又包括I型普鲁兰酶、II型普鲁兰酶(淀粉普鲁兰酶)、I型普鲁兰水解酶(新普鲁兰酶)、II型普鲁兰水解酶(异普鲁兰酶)和III型普鲁兰水解酶。其中，仅来源于Bacillus deramificans的I型普鲁兰酶得到了规模化生产和工业化应用【Bertoldo C，Antranikian G.Starch
‑
hydrolyzing enzymes from thermophilic archaea and bacteria[J].Current Opinion in Chemical Biology，2002，6(2)：151
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160.】，我们通常所说的普鲁兰酶皆指的是I型普鲁兰酶。
[0006]在淀粉的脱枝过程中，普鲁兰酶的酶学性质，如最适作用温度、最适作用pH和酶解催化效率，是影响其应用价值的主要因素。例如，在进行淀粉酶法制备葡萄糖时，普鲁兰酶可以极大地提升淀粉酶法制糖过程中葡萄糖形成比例和形成速率并可显著降低糖化酶的用量；与糖化酶糖化反应条件(pH4.5，60℃
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62℃)的一致性，则可以大幅度简化糖化工艺过程与工程控制。再如，在淀粉酶法制备麦芽糖时，在β
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淀粉酶糖化反应条件(pH5.5，55℃
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60℃)下，β
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淀粉酶与普鲁兰酶复合使用，可以提高麦芽糖的得率20％以上。但是，现有普鲁兰
酶的最适作用pH为5.0、最适作用温度为55℃，且最适作用条件范围很窄，不利于普鲁兰酶的催化作用的发挥，甚至在显著增加普鲁兰酶使用量的情况下，也不能较好发挥其淀粉脱枝作用。
[0007]通过酶分子的体外进化技术，可以有效改善特定酶分子的生化属性和催化属性，如改变其最适作用温度、最适作用pH、比酶活等。例如，删除普鲁兰酶的N
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端部分序列或C
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端部分序列，可以显著提高其耐热性并改善其异源表达水平【秦艳，谢能中，曹薇，等.Bacilliusnaganoensis普鲁兰酶基因的分子改造及酶学性质研究[J].生物技术，2014(2).】；对普鲁兰酶分子中的功能域间的连接区序列进行改造，可以显著提高其热稳定性【Xuguo Duan,Jian Chen,Jing Wu.Improving the Thermostability and Catalytic Efficiency of Bacillus deramificansPullulanase by Site
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Directed Mutagenesis[J].Applied and Environmental Microbiology,2013.】。
[0008]但是，通过定向分子进化，对长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis)普鲁兰酶(PulA)的特定氨基酸位点进行突变或组合突变，提高或降低其最适作用温度，提高其在相对较低或较高的pH(pH4.5或以下或pH5.5或以上)的活性，以及提高其在常见宿主细胞中的表达水平，以此提升其在淀粉加工中应用效果和提高其工业制备水平并降低生产成本，对优化和拓展普鲁兰酶的工业应用价值具有重要意义。

技术实现思路
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[0009]本专利技术的目的是通过定向分子进化，获得最适作用温度得到提高或降低、最适作用pH得到提高或降低、以及异源表达的水平显著提高的普鲁兰酶突变体，由此可改善普鲁兰酶的应用性能并拓展其应用领域，提升普鲁兰酶工业规模下的制造效率。
[0010]为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案是，以具有序列表SEQ ID NO.1所示核苷酸(密码子优化后获得)或序列表SEQ ID NO.2所示长野芽胞杆菌普鲁兰酶(PulA)氨基酸的为基础，通过定点突变制备突变体，通过突变体的表达与定向筛选，获得性能优良的普鲁兰酶突变体，并通过高效表达实现普鲁兰酶突变体的高效制备；
[0011]所描述的普鲁兰酶突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中的氨基酸残基S99，E100，Q108，S112，A146，A235，A272，N317，T238，N322，K327，N342，A347，T355，A356，S357，G358，T385，A414，N450，K453，K460，K463，N467，K469，K476，G479，N492，N521，N523，N587，A591，K626，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述突变体是在SEQ ID NO.2所示的野生型普鲁兰酶氨基酸序列的基础上发生以下突变中的任意一种获得的：N467G+N709R、N467G+N492A+N709R+G723S+S731C、N467G+N492A+N709R+G723S+T730S、N467G+N492A+N709R+S731C。2.权利要求1所述突变体的编码基因。3.包含权利要求2所述编码基因的重组载体或重组菌株。4.如权利要求3所述的重组载体或重组菌株，其特征在于，所述重组载体采用的表达载体包括但不限于pHY
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WZX，pHY300plk，pUB110，pE194，pHT1469质粒；所述重组菌株采用的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、枯草杆菌、地...

【专利技术属性】
技术研发人员：王正祥，牛丹丹，田康明，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：