本发明专利技术属于微生态领域，本发明专利技术提供了一株枯草芽孢杆菌新菌株，其保藏编号为CGMCC NO.25499，本发明专利技术的枯草芽孢杆菌具有良好的产酶和抑菌特性。本发明专利技术还提供了一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法。本发明专利技术通过优化芽孢杆菌发酵培养基配方，显著提升了枯草芽孢杆菌的有效活菌数。本发明专利技术通过液体深层发酵，得到液体发酵产物，将液体发酵产物接种于固体发酵培养基中，进行固体发酵，得到枯草芽孢杆菌发酵物；将枯草芽孢杆菌发酵物烘干后粉碎即得枯草芽孢杆菌菌剂。本发明专利技术利用廉价碳氮源作为培养基结合液固双相发酵工艺生产枯草芽孢杆菌菌剂，提高有效活菌数，降低菌剂的原料与后处理成本。料与后处理成本。
【技术实现步骤摘要】
一株枯草芽孢杆菌及其液固双相发酵方法
[0001]本专利技术属于微生态领域，具体而言，涉及一株枯草芽孢杆菌及其液固双相发酵方法。
技术介绍
[0002]随着集约化养殖业的发展，抗生素在畜禽饲料中的用量越来越大，抗生素的药物残留和抗药性对人类健康的影响带来许多不良影响。饲用益生菌是近年来出现的一类新型饲料添加剂，它可直接饲喂动物并通过调节动物肠道微生态平衡达到预防疾病、促进动物生长和提高饲料利用率的目的，其中芽孢杆菌是应用最广泛的一类饲用益生菌，因为芽孢杆菌以孢子形式存在，具有耐热、耐酸、耐胆盐的特性，在饲料制粒过程中损失较少，进入肠道后可以萌发为具有新陈代谢作用的益生菌群。
[0003]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有很强的抑菌作用。枯草芽孢杆菌作为益生菌，在发酵过程中能产生抑菌活性肽和淀粉酶、蛋白酶等，其发酵产物对抑制肠道有害菌、促进营养物质消化吸收有重要作用。目前，枯草芽孢杆菌主要用于抑菌植物性病原菌，防止病害、调节生长；对于金葡、大肠、沙门等动物性病原菌，枯草芽孢杆菌多数呈窄谱抑菌。
[0004]当前，国内外生产芽孢菌剂方法主要包括液体深层发酵与纯固体发酵。其中，液体深层发酵存在生产成本高、难以得到高密度的活菌与芽孢、代谢物不能充分利用、后续处理复杂(如发酵液真空浓缩，固态粉剂载体的吸附，干燥等)、有废液排放等弊端，而纯固体发酵由于多级固体扩种增加染菌风险且工艺复杂、发酵周期长，因此不适合推广使用。如何在保证有效活菌数的同时兼顾生产成本，成为困扰芽孢菌剂实际工业生产的瓶颈问题。
技术实现思路
[0005]针对上述技术问题，本专利技术提供了一株枯草芽孢杆菌新菌株。本专利技术还提出一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法旨在利用廉价碳氮源作为培养基结合液固双相发酵工艺生产枯草芽孢杆菌菌剂，提高有效活菌数，降低菌剂的原料与后处理成本，为建立规模化的发酵工艺提供参考依据。
[0006]为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0007]首先，本专利技术提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)新菌株，该菌株在LB培养基上的菌落形态为菌落乳白色，表面粗糙、边缘不规则。经16S rRNA分析鉴定为枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌BS
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ZPW，并于2022年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC NO.25499。
[0008]其次，本专利技术还提供了一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法，包括以下步骤：
[0009](1)所述枯草芽孢杆菌一级种子液培养：取所述枯草芽孢杆菌平板单菌落，接种于
一级种子培养基中，装液量50mL/150mL，37℃培养18小时，得到一级种子液；
[0010](2)所述枯草芽孢杆菌二级种子液培养：将步骤1培养的所述枯草芽孢杆菌一级种子液接种于二级种子培养基中装液量100mL/250mL，接种量3％，37℃培养8～10h，得到二级种子液；
[0011](3)所述枯草芽孢杆菌液体发酵：液体发酵培养基灭菌结束后通冷却水保温至37℃，接入二级种子液，接种量3％，搅拌速度180rpm，维持pH 7.0，通气量为0.5～1.5vvm，发酵时间为24h；
[0012](4)所述枯草芽孢杆菌固体发酵：将液体发酵后的产物接种于已灭菌的固体发酵培养基中，接种量10％(v/m)，堆料厚度3～5cm，37℃培养72h，每隔24h翻动一次培养基；
[0013](5)将所述固体发酵后的发酵物烘干粉碎后即得所述枯草芽孢杆菌菌剂。
[0014]进一步，所述步骤(1)和步骤(2)的种子培养基为LB培养基。
[0015]进一步，所述步骤(3)液体发酵培养基组分及其用量为：玉米粉5～10g/L,蔗糖4～8g/L，豆粕8～24g/L，硫酸亚铁0.125～0.5g/L，硫酸锰0.125～0.5g/L，碳酸钙0.5～2g/L，磷酸二氢钾0.5～2g/L，硫酸镁1.25～5g/L。
[0016]优选的，所述步骤(3)液体发酵培养基组分及其用量为：玉米粉5g/L，蔗糖8g/L，豆粕24g/L，硫酸亚铁0.125g/L，硫酸锰0.5g/L，碳酸钙1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁3.75g/L。
[0017]进一步，所述步骤(4)固体发酵培养基组分及其用量为：麦麸45％，葡萄糖5％，稻壳粉20％，玉米粉20％，海藻糖5％，豆粕5％或花生饼粉53％，麦麸35％，棉粕12％。
[0018]进一步，所述步骤(4)固体发酵培养基组分及其用量为：玉米粉10％，麦麸60％，稻壳粉20％，蔗糖5％，豆粕5％，料液比为60％。
[0019]进一步，所述步骤(5)具体为：将所述枯草芽孢杆菌固体发酵物在温度不高于50℃的条件下烘干至含水量10％，粉碎后即得枯草芽孢杆菌菌剂。
[0020]本专利技术还提供了含有所述枯草芽孢杆菌菌株的微生态制剂。
[0021]本专利技术还提供了含有所述的枯草芽孢杆菌菌株的饲料。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：
[0023]本专利技术提供的枯草芽孢杆菌BS
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ZPW具有良好的产酶和抑菌特性，且易培养，发酵，是一株值得开发的新型益生菌株。其次，本专利技术提供了一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法，首先利用液体发酵快速生产大量的菌体作为固体发酵的接种体，然后将液体菌液按10％的接种量混合到固体基质中，迅速形成优势菌落，并产生大量芽孢，从而缩短了发酵周期，提高了产率，减少了杂菌污染几率，节约了资源。同时发酵过程中的生防代谢产物也得以保留，克服了液体发酵代谢物不能充分利用，有废液排放等弊端。具有工艺简单，生产成本较低，节省动力，易于控制管理，活菌产量高，后处理简单等优势，有利于微生物菌剂的应用与推广。
附图说明
[0024]图1为枯草芽孢杆菌BS
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ZPW与不同菌株产蛋白酶情况，其中左上为枯草芽孢杆菌BS
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ZPW，左下为解淀粉芽孢杆菌rsc，右上为凝结芽孢杆菌NJ，右下为地衣芽孢杆菌H；
[0025]图2为枯草芽孢杆菌BS
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ZPW与不同菌株产淀粉酶情况，其中左上为凝结芽孢杆菌
NJ，左下为地衣芽孢杆菌H，右上为枯草芽孢杆菌BS
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ZPW，右下为解淀粉芽孢杆菌rsc；
[0026]图3为枯草芽孢杆菌BS
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ZPW液体发酵培养基优化情况，其中图3
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1为不同氮源对BS
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ZPW液体发酵的影响；图3
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2为不同碳源对BS
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ZPW液体发酵的影响。
具体实施方式
[0027]下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其保藏编号为CGMCC NO.25499。2.一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)所述枯草芽孢杆菌一级种子液培养：取所述枯草芽孢杆菌平板单菌落，接种于一级种子培养基中，装液量50mL/150mL，37℃培养18小时，得到一级种子液；(2)所述枯草芽孢杆菌二级种子液培养：将步骤1培养的所述枯草芽孢杆菌一级种子液接种于二级种子培养基中装液量100mL/250mL，接种量3％，37℃培养8～10h，得到二级种子液；(3)所述枯草芽孢杆菌液体发酵：液体发酵培养基灭菌结束后通冷却水保温至37℃，接入二级种子液，接种量3％，搅拌速度180rpm，维持pH 7.0，通气量为0.5～1.5vvm，发酵时间为24h；(4)所述枯草芽孢杆菌固体发酵：将液体发酵后的产物接种于已灭菌的固体发酵培养基中，接种量10％(v/m)，堆料厚度3～5cm，37℃培养72h，每隔24h翻动一次培养基；(5)将所述固体发酵后的发酵物烘干粉碎后即得所述枯草芽孢杆菌菌剂。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)的种子培养基为LB培养基。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：庞远祥，崔东良，张海亮，韩瑞玲，万红兵，吴昊，张乐，孙晓杰，刘滢，李碧晨，黄翠英，范祥伟，刘雪连，
申请(专利权)人：北京大北农科技集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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