ZSCAN4核酸和蛋白质向细胞和组织的基于温度的瞬时递送制造技术

本公开文本涉及用于在一个或多个细胞中瞬时激活温度敏感性药剂的方法，例如通过使一个或多个细胞与温度敏感性药剂接触并在允许温度下瞬时孵育所述细胞以诱导所述细胞中温度敏感性药剂的活性。另外，本公开文本涉及使受试者中的一个或多个细胞与温度敏感性药剂接触，然后将所述受试者的体温降低至允许温度以诱导所述细胞中温度敏感性药剂的活性的方法。本公开文本还涉及用温度敏感性治疗剂治疗受试者的方法。特别地，本公开文本提供了用于将ZSCAN4核酸和蛋白质温度敏感地递送至细胞的工具。的工具。的工具。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】ZSCAN4核酸和蛋白质向细胞和组织的基于温度的瞬时递送
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2020年3月20日提交的美国临时申请号62/992,745和2019年12月31日提交的美国临时申请号62/955,820的权益，将这些申请的公开文本通过引用以其全文特此并入。以ASCII文本文件提交序列表
[0002]将以下提交的ASCII文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名称：699442001340SEQLIST.TXT，记录日期：2020年12月23日，大小：25KB)。


[0003]本公开文本涉及用于在一个或多个细胞中瞬时激活温度敏感性药剂(ts药剂)的方法，例如通过使一个或多个细胞与ts药剂接触并在允许温度下瞬时孵育细胞以诱导所述细胞中ts药剂的活性。对于离体治疗策略，将一个或多个细胞在允许温度下用治疗性ts药剂离体处理，随后在非允许温度(例如，受试者的正常核心体温)下将细胞转移到受试者。对于体内治疗策略，将治疗性ts药剂递送至维持在允许温度下的受试者，从而允许所述治疗性ts药剂在有限的时间内在体内起作用，然后当受试者的体温恢复正常时或当受试者的表面体温升高(例如，非允许温度)时，永久关闭ts药剂。可替代地，将治疗性ts药剂递送至受试者，随后通过将受试者的核心体温降低至允许温度以诱导受试者的细胞中治疗性ts药剂的活性来瞬时激活ts药剂。特别地，本公开文本提供了用于将ZSCAN4核酸和蛋白质温度敏感地递送至细胞的工具。

技术介绍

[0004]将治疗性基因产物递送至人体细胞、组织和器官是巨大的挑战。对于需要持续表达基因以补充患者中基因缺陷的传统基因疗法，这已经通过使用病毒载体如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒实现。然而，同样重要的策略基因疗法涉及基因的瞬时、短期表达。对于这样的应用，不需要基因的持续表达，并且实际上这可能对细胞有害。
[0005]例如，CAS9是切割DNA的细菌酶。它是基于CRISPR/CAS9的基因编辑复合物的重要组分，其已被考虑用于基因疗法。指导RNA和CAS9均可由单个仙台病毒载体上的基因编码(Park等人,2016)。为了在治疗上使用基因编辑系统，必须将含有CRISPR
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CAS9的载体引入人体细胞或人体内。然而，CAS9的持续表达可导致DNA断裂和突变的引入。因此，希望CAS9在短时间内表达，例如，约数小时或数天，而不是一周或更长时间。
[0006]基因短期表达的另一个应用是用于细胞重编程。最近，已经表明一组转录因子的异位表达可以将细胞转化为治疗上有用的细胞类型。例如，一组三种转录因子可以将胰管细胞转化为分泌胰岛素的胰腺β细胞(Zhou等人,2008)。另一组转录因子可以将成纤维细胞转化为心肌细胞(Ieda等人,2010)。认为将这些转录因子体内递送至人体内可用作一种类型的再生医学。然而，希望使这些有效的改变细胞身份的转录因子仅瞬时表达，因为这些有
效转录因子的持续表达可能造成损害。
[0007]如上述例子所强调的，使用导致基因持续表达的病毒载体的传统基因疗法可能是不希望的。对于基因产物的限时表达，已经开始使用将合成的或体外转录的mRNA递送至细胞中(Warren等人,2010)。然而，这些方法存在若干问题。例如，递送至细胞、组织和器官的mRNA的量是有限的，因此，蛋白质产物的量可能不足以在体内产生具有生物学意义的效果。
[0008]此外，由于RNA的快速更新(turn
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over)，其通常仅持续最多12小时(Warren等人,2010；Goparaju等人,2017)，必须多次将合成的RNA转染到细胞中。对于人多能干细胞如胚胎干细胞和诱导多能干细胞(iPS)的强制分化，需要在几天的过程内每天转染两次(Akiyama等人,2016；Goparaju等人2017)。为了从人成纤维细胞生成iPS细胞，必须持续超过两周每天转染合成RNA的混合物(Warren等人,2010)。这不仅麻烦，而且效率低。
[0009]对于iPS细胞的生成，这个问题通过使用自我复制RNA来解决，这使得仅在一次递送后能够长期表达(Yoshioka等人,2013)。自我复制RNA是单链RNA，其通常通过去除编码病毒颗粒形成所需的结构蛋白的DNA而从甲病毒(Jose等人,2009)，例如委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、辛德比斯病毒(SINV)和塞姆利基森林病毒(SFV)产生(Petrakova等人,2005)。自我复制RNA编码非结构蛋白(nsP)，所述非结构蛋白作为RNA依赖性RNA聚合酶来复制自我复制RNA自身并产生用于翻译的转录物。自我复制RNA也可包括编码目的蛋白的目的基因(GOI)和其他遗传元件。由于其RNA的正反馈产生，自我复制RNA可以以高水平表达GOI。可以将自我复制RNA作为裸RNA(即合成RNA)或作为病毒颗粒递送至哺乳动物细胞，所述病毒颗粒可通过包装辅助细胞补充缺失的病毒结构蛋白而产生。
[0010]自我复制RNA载体的优点是它们的自我复制特征，这导致GOI表达水平的增强。然而，将RNA/蛋白质递送至哺乳动物细胞的自我复制RNA载体的缺点之一是它们的持续表达。通常，RNA依赖性RNA聚合酶和GOI的正反馈产生会持续，这可导致用裸RNA形式的自我复制RNA转染或用病毒形式的自我复制RNA感染的细胞死亡。
[0011]因此，基因疗法领域需要瞬时表达编码目的蛋白质的GOI的工具，例如治疗剂(例如人ZSCAN4)。特别地，期望控制RNA载体和自我复制RNA的转录和翻译。

技术实现思路

[0012]基于目的基因(GOI)限时表达的必要性，需要瞬时基因产物递送系统，其中核酸或蛋白质可以在体外或体内被递送至特定细胞或在特定细胞中表达，其中核酸/蛋白质的量足以具有生物学上有意义的效果，并且其中瞬时表达可以在实现生物学上有意义的效果后永久关闭。为了满足这些和其他需要，本公开文本涉及用于在受试者中(体内)或在培养的细胞中(离体)瞬时诱导温度敏感性药剂(ts药剂)如治疗性ts药剂的活性的工具。在一些实施方案中，所述治疗性ts药剂与温和的治疗性低体温组合使用。在其他实施方案中，所述治疗性ts药剂与温和的治疗性高体温或局部加热组合使用。在一些实施方案中，所述ts药剂是ts
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RNA分子或ts
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蛋白质分子。在一些实施方案中，所述ts药剂由插入温度敏感性病毒载体中的异源核酸或自我复制RNA编码。在一些实施方案中，所述病毒载体选自但不限于仙台病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和α病毒载体。在一些实施方案中，所述自我复制RNA包含缺乏病毒结构蛋白编码区的甲病毒复制子。在一些实施方案中，所述甲病毒选自但不限于委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒。特别
感兴趣的基因产物是ZSCAN4，特别是人ZSCAN4。
[0013]本公开文本的上述和其他目的和特征将从以下参照附图进行的详细描述中变得更清楚。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种治疗血液或造血器官疾病的方法，所述方法包括：i)将造血干细胞从骨髓动员至患有所述疾病的人受试者的外周血；ii)从获自所述受试者的外周血单个核细胞样品分离CD34+细胞；iii)在33℃
±
0.5℃的温度下孵育所述分离的CD34+细胞；iv)使所述孵育的CD34+细胞与包含含有人ZSCAN4的编码区的异源核酸的温度敏感性仙台病毒载体接触；v)将所述接触的CD34+细胞在33℃
±
0.5℃的允许温度下维持至少约12
‑
72小时，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录在所述允许温度下发生，导致人ZSCAN4的表达增加；以及vi)在适于植入所述细胞以治疗所述疾病的条件下将所述接触的CD34+细胞输注到所述受试者中。2.一种治疗血液或造血器官疾病的方法，所述方法包括：i)将造血干细胞从骨髓细胞动员至患有所述疾病的人受试者的外周血；ii)从获自所述受试者的外周血单个核细胞样品分离CD34+细胞；iii)使所述分离的CD34+细胞与包含含有人ZSCAN4的编码区的异源核酸的温度敏感性仙台病毒载体接触；iv)将所述接触的CD34+细胞在33℃
±
0.5℃的允许温度下孵育至少约12
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72小时，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录在所述允许温度下发生，导致人ZSCAN4的表达增加；以及v)在适于植入所述细胞以治疗所述疾病的条件下将所述接触的CD34+细胞输注到所述受试者中。3.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括在步骤v)之后，在将所述接触的CD34+细胞输注到所述受试者中之前，在37℃
±
0.5℃的非允许温度下孵育所述接触的CD34+细胞，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录以及人ZSCAN4的表达在所述非允许温度下停止。4.根据权利要求2所述的方法，所述方法进一步包括在步骤iv)之后，在将所述接触的CD34+细胞输注到所述受试者中之前，在37℃
±
0.5℃的非允许温度下孵育所述接触的CD34+细胞，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录以及人ZSCAN4的表达在所述非允许温度下停止。5.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中将所述接触的CD34+细胞在37℃
±
0.5℃的非允许温度下孵育约30分钟至约10天，任选地约30
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180分钟。6.根据权利要求5所述的方法，其中通过向所述受试者施用粒细胞集落刺激因子和普乐沙福中之一或二者来动员所述造血干细胞。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述外周血单个核细胞通过单采术从所述受试者获得。8.根据权利要求7所述的方法，其中通过使用抗CD34抗体和磁珠进行阳性选择从所述外周血单个核细胞分离所述CD34+细胞。9.根据权利要求8所述的方法，其中在输注之前将所述接触的CD34+细胞洗涤并重悬于无菌等渗水溶液中。
10.根据权利要求9所述的方法，其中将所述接触的CD34+细胞以约1.0x 10^5个细胞/kg至约1.0x 10^7个细胞/kg，任选地约2.0
‑
8.0x 10^6个细胞/kg的剂量静脉内输注。11.一种治疗血液或造血器官疾病的方法，所述方法包括：i)向患有所述疾病的人受试者施用包含含有人ZSCAN4的编码区的异源核酸的温度敏感性仙台病毒载体；ii)将所述受试者的核心体温降低至33℃
±
0.5℃的允许温度；iii)将所述受试者的核心体温在所述允许温度下维持约12小时至约7天或约12
‑
72小时的时间段，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录在所述允许温度下发生，导致人ZSCAN4的表达增加；以及iv)允许所述受试者的核心体温返回到37℃
±
0.5℃的正常非允许温度，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录以及人ZSCAN4的表达在所述非允许温度下停止。12.一种治疗血液或造血器官疾病的方法，所述方法包括：i)将患有所述疾病的受试者的所述核心体温降低至33℃
±
0.5℃的允许温度；ii)向所述受试者施用包含含有人ZSCAN4的编码区的异源核酸的温度敏感性仙台病毒载体；iii)将所述受试者的核心体温在所述允许温度下维持约12小时至约7天或约12
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72小时的时间段，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录在所述允许温度下发生，导致人ZSCAN4的表达增加；以及iv)允许所述受试者的核心体温返回到37℃
±
0.5℃的正常非允许温度，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录以及人ZSCAN4的表达在所述非允许温度下停止。13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中使用目标温度管理(TTM)程序降低所述受试者的核心体温，其中所述TTM程序包括向所述受试者施加由冷却导管、冷却毯和冰块组成的组中的一种。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述人受试者在治疗前被诊断患有骨髓衰竭，任选地其中所述骨髓衰竭包括中性粒细胞减少症、血小板减少症和贫血中的一种或多种。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述受试者不患有癌症。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述疾病是端粒生物学障碍。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述端粒生物学障碍选自先天性角化不良、Hoyeraal
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Hreidarsson综合征、Revesz综合征、Coats plus综合征、特发性肺纤维化和肝硬化。18.根据权利要求16所述的方法，其中所述端粒生物学障碍由以下中之一或二者定义：i)外周血淋巴细胞、B细胞和幼稚T细胞中的一种或多种中年龄标化平均端粒长度小于1百分位数；以及ii)选自DKC1、TERC、TERT、NOP10、NHP2、TINF2、CTC1、PARN、RTEL1、ACD、USB1和WRAP53的基因中的致病突变。19.根据权利要求13所述的方法，其中所述疾病是骨髓衰竭综合征。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述骨髓衰竭综合征选自范可尼贫血、无巨核细胞血小板减少症、再生障碍性贫血、Diamond Blackfan贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、皮尔逊综合征、Shwachman Diamond综合征和骨髓增生异常综合征。
21.根据权利要求14所述的方法，其中所述疾病与核型异常相关。22.一种温度敏感性药剂，其中所述药剂是温度敏感性病毒载体或温度敏感性自我复制RNA，其包含含有人ZSCAN4的编码区的异源核酸和插入12
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18个核苷酸的非结构蛋白编码区，其中所述插入导致在所述nsP2的β片层5与β片层6之间包含4至6个另外的氨基酸的非结构蛋白2(nsP2＝解旋酶蛋白酶)的表达，任选地其中所述另外的氨基酸导致所述病毒载体或所述自我复制RNA的温度敏感性。23.根据权利要求22所述的温度敏感性药剂，其中所述另外的氨基酸包含选自SEQ ID NO:43(GCGRT)、SEQ ID NO:44(TGAAA)和SEQ ID NO:45(LRPHP)的一个序列。24.根据权利要求22所述的温度敏感性药剂，其中所述另外的氨基酸包含SEQ ID NO:44(TGAAA)的序列。25.根据权利要求24所述的温度敏感性药剂，其中所述NsP2的氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:29
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36的一个序列。26.根据权利要求22所述的温度敏感性药剂，其中所述药剂是温度敏感性甲病毒载体。27.根据权利要求22所述的温度敏感性药剂，其中所述药剂是包含缺乏病毒结构蛋白编码区的甲病毒复制子的温度敏感性自我复制RNA。28.根据权利要求26或权利要求27所述的温度敏感性药剂，其中所述甲病毒选自委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒。29.根据权利要求26或权利要求27所述的温度敏感性药剂，其中所述甲病毒是委内瑞拉马脑炎病毒。30.一种用于在受试者中瞬时诱导温度敏感性药剂(ts药剂)的温度敏感性活性的方法，其中所述ts药剂是温度敏感性病毒载体或温度敏感性自我复制RNA，其包含含有人ZSCAN4的编码区的异源核酸，其中所述受试者的身体表面处或附近的一个或多个细胞包含所述ts药剂，其中所述ts药剂的温度敏感性活性包括在允许温度下表达人ZSCAN4，并且其中所述允许温度是所述受试者的表面体温，所述方法包括：i)将所述受试者的表面体温在所述允许温度下维持一定的时间段，所述时间段足以使所述温度敏感性活性在所述受试者中诱导效果；以及ii)将所述受试者的表面体温升高至非允许温度，持续一定的时间段，所述时间段足以使所述受试者中的所述温度敏感性活性停止。31.一种用于在受试者中瞬时诱导温度敏感性药剂(ts药剂)的温度敏感性活性的方法，其中所述ts药剂是温度敏感性病毒载体或温度敏感性自我复制RNA，其包含含有人ZSCAN4的编码区的异源核酸，其中所述ts药剂的温度敏感性活性包括在允许温度下表达人ZSCAN4，并且其中所述允许温度是所述受试者的表面体温，所述方法包括：i)将所述ts药剂施用至所述受试者的身体表面处或附近的一个或多个细胞；以及ii)将所述受试者的表面体温在所述允许温度下维持一定的时间段，所述时间段足以使所述温度敏感性活性在所述受试者中诱导效果。32.根据权利要求31所述的方法，所述方法进一步包括iii)将所述受试者的表面体温升高至非允许温度，持续一定的时间段，所述时间段足以使所述受试者中的所述温度敏感性活性停止。33.根据权利要求31所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂皮内或皮下施用。
34.根据权利要求31所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂肌内施用。35.根据权利要求30
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34中任一项所述的方法，其中所述允许温度是30℃至36℃、或31℃至35℃、或32℃至34℃、或33℃
±
0.5℃，所述非允许温度是37℃
±
0.5℃。36.根据权利要求35所述的方法，其中人ZSCAN4的表达的所述效果是预防效果或治疗效果。37.根据权利要求35所述的方法，其中所述ts药剂是温度敏感性病毒载体并且所述温度敏感性活性进一步包括所述温度敏感性病毒载体的复制和转录。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述温度敏感性病毒载体选自仙台病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和甲病毒。39.根据权利要求37所述的方法，其中所述温度敏感性病毒载体是甲病毒，任选地其中所述甲病毒选自委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒。40.根据权利要求37所述的方法，其中所述温度敏感性病毒载体是仙台病毒。41.根据权利要求35所述的方法，其中所述ts药剂是温度敏感性自我复制RNA，并且所述温度敏感性活性进一步包括所述温度敏感性自我复制RNA的复制和转录...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：伊利克斯根治疗公司，
类型：发明
国别省市：