一种向中华绒螯蟹胚胎导入外源物质的方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种向中华绒螯蟹胚胎导入外源物质的方法，步骤如下：利用显微注射针在河蟹胚胎表面造成极微小创口，向显微注射针中灌注好外源活性物质，然后通过显微注射仪进行外部施压推进，将显微注射针中灌注好的外源活性物质导入河蟹胚胎内部；其中，所述极微小创口的造口直径<10μm、体积>10pl，机器进行外部施压推进时的温度为20

【技术实现步骤摘要】
一种向中华绒螯蟹胚胎导入外源物质的方法与应用


[0001]本专利技术属于水产
，尤其是一种向中华绒螯蟹胚胎导入外源物质的方法与应用。

技术介绍

[0002]中华绒螯蟹(学名：Eriocheir sinensis)是弓蟹科、绒螯蟹属甲壳类动物，又名河蟹、大闸蟹。雄性掌、指节基半部的内、外面均密具绒毛，而雌性的绒毛只在外侧存在，内侧无毛。每年在11月末到12月初公母蟹会从淡水中洄游到海水里完成交配，之后进行第一次抱卵；在第二年五月份经过第一次抱卵的母蟹会进行二次抱卵。中华绒螯蟹作为主要的经济类水产动物，其生长和发育、病害防治等方面都备受关注。现有技术不能对河蟹胚胎进行外源活性物质的递送，无法开展基因编辑、胚胎操作等实验技术。
[0003]基于市场对河蟹的需求，目前已经研究出了诸如长江1号、江海21号、光合1号等多种优良品种；然而传统的选育方法工作量大，耗时长，无法快速获得定向突变的河蟹品种。
[0004]通过检索，发现如下几篇与本专利技术专利申请相关的公开文献：
[0005]1、基于脊尾白虾胞苷脱氨酶的单碱基基因编辑系统及其构建和应用(CN111118045A)，，所述的单碱基基因编辑系统包含能够表达融合蛋白的mRNA和目的编辑位点对应的gRNA，所述融合蛋白包含D10A缺陷型Cas9蛋白和脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA，所述的脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA对应的基因序列如SEQ ID NO.1所示。本专利技术为研究甲壳动物SNP位点的功能提供了新的技术手段，有利于甲壳动物基因功能的研究，并对经济甲壳动物分子精准育种的实施和发展提供了基础。
[0006]2、一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因及其应用(CN111088257A)，所述基因的序列如SEQ ID NO.1所示。所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白包含三个结构域，分别为EcVBP
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PC1、EcVBP
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PC2、EcVBP
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PC3。上述基因EcVBP在卵黄蛋白结合蛋白介导外源蛋白进入甲壳动物受精卵中的应用。利用本专利技术提供的基因成功地将外源蛋白导入中华锯齿米虾的受精卵中，从而证实了VBP作为“分子货车”携带外源蛋白进入甲壳动物受精卵的可行性，为今后开展甲壳动物的基因编辑与分子设计育种提供了基础。
[0007]3、脊尾白虾复眼发育调控基因与引导RNA和获取及应用(CN111849997A)，涉及一种脊尾白虾复眼发育调控基因EcEy被成功编辑后可以在胚胎时期出现表型的明显变化，以指示基因编辑操作的成功率，此基因也可应用到其他十足目甲壳动物基因编辑平台的建立。本专利技术所涉及的脊尾白虾EcEy基因具有序列列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；基于该序列设计合成的引导RNA(gRNA)具有序列列表中SEQ ID No.2所示的核糖核酸序列，将Ec Ey
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gRNA与商品化Cas 9mRNA混合注射脊尾白虾受精卵，可以特异性地识别EcEy基因的PAX结构域并进行切割，在胚胎发育早期观察到明显的复眼缺陷表型。EcEy基因可作为脊尾白虾基因编辑研究的靶基因，用于验证基因编辑操作成功与否，也可用于其他十足目甲壳动物基因编辑平台的建立。
[0008]4、ORCID ID:0000
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0001
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5063
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339X(J.Z.)
[0009]通过对比，公开文献1
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4虽然报道了对于脊尾白虾的胚胎注射，但由于河蟹有别于脊尾白虾的特殊的生活习性和生殖过程以及特殊的胚胎结构以及发育过程，导致公开文献1
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4的实验思路在河蟹的研究中受阻，因此本专利技术专利申请与上述公开文献存在本质的不同。
[0010]截止到本专利申请时为止，没有成功的河蟹胚胎导入技术对外公开，另外，也没有河蟹基因编辑的成功报道。

技术实现思路

[0011]本专利技术目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种向中华绒螯蟹胚胎导入外源物质的方法与应用。
[0012]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0013]一种向中华绒螯蟹胚胎导入外源物质的方法，步骤如下：
[0014]利用显微注射针在河蟹胚胎表面造成极微小创口(能够解决胚胎爆裂或内容物外泄等造成的高死亡率)，向显微注射针中灌注好外源活性物质，然后通过显微注射仪进行外部施压推进，将显微注射针中灌注好的外源活性物质导入河蟹胚胎内部；
[0015]其中，所述极微小创口的造口直径<10μm、体积>10pl，机器进行外部施压推进时的温度为20
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25℃、压强为1.5atm。
[0016]进一步地，所述方法还包括如下步骤：
[0017]将已经导入外源活性物质的创伤后胚胎静置培养在18
‰
(质量百分数)海水中并于20
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25℃培养3
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4天，之后转移至特定培养条件下进行培养，该特定培养条件为氨氮<0.1mg/l、亚硝酸<0.001mg/l、外部压强1.5
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1.8atm、溶氧>7mg/l，20
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25℃培养30天。
[0018]进一步地，所述外源活性物质为：非河蟹物种自身的可测量的蛋白质、核酸、激素、维生素、脂质体、外泌体、病毒，外源活性物质的分子量>18，含量>1pl。
[0019]进一步地，所述外源活性物质为：非河蟹物种自身基因组、转录组、蛋白组、代谢组、连接组可测量的蛋白质、核酸、激素、维生素、脂质体、外泌体、病毒。
[0020]进一步地，所述河蟹物种自身的基因组、转录组、蛋白组、代谢组、连接组中分子量>18的可测量的特定分子或复合体超过该物质在河蟹群体平均含量1％。
[0021]进一步地，所述河蟹物种包括杂交、突变以及基因修饰个体。
[0022]进一步地，步骤如下：
[0023]借助显微注射导入CRISPR/Cas9系统以对河蟹胚胎进行基因敲除的方式，具体步骤如下：
[0024]S1.注射试剂的合成：考虑蟹卵体积较小，Cas9蛋白用灭菌超纯水稀释至300ng/μL，sgR NA稀释至终浓度为200ng/μL；之后按照Cas9蛋白：sgRNA为3：2的摩尔比混匀后，于室温25℃孵育10min，即得Cas9
‑
sgRNA混合液；再用微量上样器将Cas9
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sgRNA混合液混合加入到显微注射针中；
[0025]S2.注射前的蟹卵准备：清洗过后将蟹卵先置于冰上短暂保存，防止分裂；
[0026]S3.蟹卵的固定：取一张灭过菌的圆形滤纸铺在培养皿盖子上，滴加新鲜卤水使滤纸贴附在皿盖内；另对半裁开一张圆形滤纸，用卤水叠加在第一张滤纸上，叠加处用于放置
排布分装后的蟹卵；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种向中华绒螯蟹胚胎导入外源物质的方法，其特征在于：步骤如下：利用显微注射针在河蟹胚胎表面造成极微小创口，向显微注射针中灌注好外源活性物质，然后通过显微注射仪进行外部施压推进，将显微注射针中灌注好的外源活性物质导入河蟹胚胎内部；其中，所述极微小创口的造口直径<10μm、体积>10pl，机器进行外部施压推进时的温度为20
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25℃、压强为1.5atm。2.根据权利要求1所述的向中华绒螯蟹胚胎导入外源物质的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：将已经导入外源活性物质的创伤后胚胎静置培养在18
‰
(质量百分数)海水中并于20
‑
25℃培养3
‑
4天，之后转移至特定培养条件下进行培养，该特定培养条件为氨氮<0.1mg/l、亚硝酸<0.001mg/l、外部压强1.5
‑
1.8atm、溶氧>7mg/l，20
‑
25℃培养30天。3.根据权利要求1或2所述的向中华绒螯蟹胚胎导入外源物质的方法，其特征在于：所述外源活性物质为：非河蟹物种自身的可测量的蛋白质、核酸、激素、维生素、脂质体、外泌体、病毒，外源活性物质的分子量>18，含量>1pl。4.根据权利要求3所述的向中华绒螯蟹胚胎导入外源物质的方法，其特征在于：所述外源活性物质为：非河蟹物种自身基因组、转录组、蛋白组、代谢组、连接组可测量的蛋白质、核酸、激素、维生素、脂质体、外泌体、病毒。5.根据权利要求1所述的向中华绒螯蟹胚胎导入外源物质的方法，其特征在于：所述河蟹物种自身的基因组、转录组、蛋白组、代谢组、连接组中分子量>18的可测量的特定分子或复合体超过该物质在河蟹群体平均含量1％。6.根据权利要求5所述的向中华绒螯蟹胚胎导入外源物质的方法，其特征在于：所述河蟹物种包括杂交、突变以及基因修饰个体。7.根据权利要求1所述的向中华绒螯蟹胚胎导入外源物质的方法，其特征在于：步骤如下：借助显微注射导入CRISPR/Cas9系统以对河蟹胚胎进行基因敲除的方式，具体步骤如下：S1.注射试剂的合成：考虑蟹卵体积较小，Cas9蛋白用灭菌超纯水稀释至300ng/μL，sgRNA稀释至终浓度为200ng/μL；之后按照Cas9蛋白：sgRNA为3：2的摩尔比混匀后，于室温25℃孵育10min，即得Cas9
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sgRNA混合液；再用微量上样器将Cas9
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sgRNA混合液混合加入到显微注射针中；S2.注射前的蟹卵准备：清洗过后将蟹卵先置于冰上短暂保存，防止分裂；S3.蟹卵的固定：取一张灭过菌的圆形滤纸铺在培养皿盖子上，滴加新鲜卤水使滤纸贴附在皿盖内；另对半裁开一张圆形滤纸，用卤水叠加在第一张滤纸上，叠加处用于放置排布分装后的蟹卵；用布氏管将二次清洗后的蟹卵加在滤纸上，在折叠滤纸和底部平铺滤纸的叠痕处排成一列，并借助滤纸上少量的海水对胚胎产生的吸力同时完成河蟹胚胎的固定；S4.蟹卵的注射：注射时使用显微注射仪，机器参数：平衡压5
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6000hPa、注射压5
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6000hPa、注射体积1pL
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1000μL；首先把排列好的蟹卵置于体视镜载物台上，并调整其位置到视野中直至看到数目最多的胚胎；之后将灌入sgRNA
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Cas9混合物的注射针固定在悬臂的持针器上，通过摇杆渐渐使注射针下降并在显微镜视野下靠近排列好的蟹卵；环境大气压
为1.5atm，调整气泵的注射参数为：注射持续时间为0
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60s；平衡压为1
‑
500...

【专利技术属性】
技术研发人员：李冉，孙金生，齐佳辰，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：