斑马鱼心脏发育相关基因簇缺失突变体中主效基因的筛选方法和应用技术

本发明专利技术公开了斑马鱼心脏发育相关基因簇缺失突变体中主效基因的筛选方法和应用，包括确定斑马鱼hoxbb基因簇中hoxb1b、hoxb5b、hoxb6b和hoxb8b基因的靶点位置并分别设计靶点gRNA序列和引物进行PCR扩增，体外转录获得gRNA与Cas9mRNA显微注射到斑马鱼中，有突变的斑马鱼与野生型杂交得杂合子F1，性成熟的F1交配得纯合突变体，对基因敲除的后代显微成像和单基因鉴定初步筛选具有明显表型的基因hoxb1b，单细胞测序数据分析hoxbb中四个单基因早期表达情况和原位杂交、基因敲低与过表达筛选出与心脏早期发育相关的主效基因hoxb1b，有助于寻找致病靶点和药物筛选。有助于寻找致病靶点和药物筛选。有助于寻找致病靶点和药物筛选。

【技术实现步骤摘要】
斑马鱼心脏发育相关基因簇缺失突变体中主效基因的筛选方法和应用


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及斑马鱼心脏发育相关基因簇缺失突变体中主效基因的筛选方法和应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas技术是继ZFIN及TELEN后近几年比较火热的基因编辑系统，基于其具有简单、高效、易操作等优势已经在全球多种模式生物中得到广泛应用。研究初期主要发现两个CRISPR/Cas9作用系统：I型和III型。随着科学技术的进步与发展，来自加州大学伯克利分校和奥摩大学的两位博士与2012年合作发现了一种Ⅱ型的CRISPR/Cas9系统。这个系统构成简单，仅仅需要两端的RNA以及Cas9的核酸内切酶就可以行使对靶位点的切割功能。后来，来自麻省理工的张峰和哈佛医学院的George Church两个实验室同时将Cas9系统作用于人类的细胞中并产生有效切割作用。随后CRISPR/Cas9在全世界的实验室相继展开并且成功地在各个模式动物中应用开来。由CRISPR/Cas9介导的基因敲除工作已经涉及到从细菌到鱼类再到灵长类。这一过程对各层生物进化阶段的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.斑马鱼心脏发育相关基因簇缺失突变体中主效基因的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、确定斑马鱼hoxbb基因簇中hoxb1b、hoxb5b、hoxb6b和hoxb8b四个基因的靶点位置并分别设计靶点gRNA序列；S2、分别设计并合成上述四个靶点的gRNA上游引物和gRNA下游引物；S3、以gRNA骨架质粒为模板，分别使用上述gRNA上游引物和gRNA下游引物进行PCR扩增；S4、对步骤S3的PCR产物进行体外转录，纯化获得hoxb1b、hoxb5b、hoxb6b和hoxb8b的gRNA；S5、上述纯化后的gRNA和Cas9 mRNA分别显微注射到单细胞的斑马鱼胚胎中，24h后提取DNA进行T7E1酶检测；S6、待斑马鱼性成熟后，将存在突变的斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，得到hoxb1b、hoxb5b、hoxb6b、hoxb8b基因型的杂合子F1，将杂合子F1成鱼连接转化后鉴定基因型，性成熟后的F1进行交配，得到纯合突变体；S7、对hoxb1b、hoxb5b、hoxb6b和hoxb8b基因成功敲除的后代显微成像，并进行单基因鉴定，根据不同单位点缺失的纯合突变体对应的图像筛选具有明显表型的基因；S8、对斑马鱼分别在10hpf、14hpf和18hpf单细胞测序结果分析，筛选在早期心脏发育存在明显表达的基因，同时结合hoxbb簇中hoxb1b、hoxb5b、hoxb6b和hoxb8b单基因的原位杂交表达情况，与步骤S7的结果相互对照筛选hoxbb簇中的主效基因，其为hoxb1b。2.根据权利要求1所述斑马鱼心脏发育相关基因簇缺失突变体中主效基因的筛选方法，其特征在于，步骤S1中，hoxb1b、hoxb5b、hoxb6b和hoxb8b基因的靶点gRNA序列分别如SEQ ID NO:1
–
4所示。3.根据权利要求1所述斑马鱼心脏发育相关基因簇缺失突变体中主效基因的筛选方法，其特征在于，步骤S2中，gRNA上游引物为T7+Target site+gRNA正向引物，分别为序列如SEQ ID NO:5
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8所示的引物T7
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hoxb1b
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sfd、T7
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hoxb5b
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sfd、T7
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hoxb6b

【专利技术属性】
技术研发人员：祖尧，王冰琦，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：