斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体的制备方法和应用，包括：确定hoxba基因簇的敲除靶点分别位于hoxb13a基因的第1个外显子上和hoxb1a基因的第1个外显子上设计gRNA序列，以gRNA骨架质粒为模板进行PCR扩增，PCR产物纯化、体外转录获得gRNA，将hoxb13a和hoxb1a的gRNA与Cas9蛋白混合共同导入到斑马鱼中，培养获得稳定遗传的hoxba基因簇缺失突变体。本发明专利技术为基因组上多个连续基因共同敲除并获得稳定突变体提供方式方法，同时该突变体的表型为研究hoxba基因簇的生物学功能及与hoxba基因簇缺失相关的疾病奠定基础。因簇缺失相关的疾病奠定基础。因簇缺失相关的疾病奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体的制备方法和应用


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]CRISPR
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Cas9是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，短短几年内，CRISPR
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Cas9技术风靡全球，成为现有基因编辑和基因修饰里面效率高、简便、成本低、容易上手的技术之一，成为当今主流的基因编辑系统。CRISPR/Cas9系统是建立在一种原核免疫机制的基础上的，它可以防御核酸的入侵，属于细菌和古细菌的适应性免疫防御机制。它是在生物不断进化的过程中产生，用来保护自身基因组免受外源核酸的干扰。最早于1987年被大阪大学(Osaka University)的研究人员发现，到2012年，Doudna与Charpentier两个团队合作对WT的产脓链球菌Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas系统进行改造，将tracrRNA和crRNA整合为一条单链，称为crRNA:tracrRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、确定hoxba基因簇敲除的靶点分别在斑马鱼hoxb13a基因第1个外显子和hoxb1a基因第1个外显子上设计gRNA序列；S2、设计合成gRNA的上游引物T7
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hoxb13a
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sfd、T7
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hoxb1a
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sfd、下游gRNA反向引物；S3、以gRNA骨架质粒为模板，使用上游引物T7
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hoxb13a
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sfd、T7
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hoxb1a
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sfd和gRNA反向引物分别进行PCR扩增；S4、对步骤S3的PCR产物进行体外转录，转化获得hoxb13a gRNA和hoxb1a gRNA；S5、将上述hoxb13a gRNA和hoxb1a gRNA与Cas9蛋白混合后显微注射导入到斑马鱼一细胞期胚胎中；S6、培养获得稳定遗传的斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体。2.根据权利要求1所述的斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体的制备方法，其特征在于，步骤S1中，hoxb13a基因的gRNA序列如SEQ ID NO:1所示，hoxb1a基因的gRNA序列SEQ ID NO:2所示。3.根据权利要求1所述的斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体的制备方法，其特征在于，步骤S2中，T7
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hoxb13a
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sfd、T7
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hoxb1a
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sfd和gRNA反向引物的序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。4.根据权利要求1所述的斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体的制备方法，其特征在于，步骤S4中，hoxb13a gRNA的序列如SEQ ID NO:6所示，hoxb1a gRNA的序列如SEQ ID NO:7所示。5.根据权利要求1所述的斑马鱼hoxba基因簇缺失突变体的制备方法，其特征在于，步骤S5中，hox...

【专利技术属性】
技术研发人员：祖尧，何宏阳，胡沛男，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：